Báo cáo Tóm tắt Nghiên cứu quy trình chiết xuất chất màu tự nhiên r-phycoerythrin từ rong biển đỏ

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT BÁO CÁO TÓM TẮT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CHẤT MÀU TỰ NHIÊN R-PHYCOERYTHRIN TỪ RONG BIỂN ĐỎ Mã số: B2018-ĐN06-14 Chủ nhiệm đề tài: TS. NGUYỄN HỮU PHƯỚC TRANG Đà Nẵng, Tháng 7 năm 2020 i BÁO CÁO TÓM TẮT ii DANH SÁCH THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI STT Họ và tên Vai trò Đơn vị công tác 1 TS. Nguyễn Hữu Phƣớc Trang Chủ nhiệm Khoa Công nghệ Hóa học – Môi trƣờng, Trƣờng ĐH Sƣ phạm Kỹ Thuật- Đại học Đà Nẵng 2 ThS. Trần Thị Ngọc Linh Thành viên Khoa Công nghệ Hóa học – Môi trƣờng, Trƣờng ĐH Sƣ phạm Kỹ Thuật- Đại học Đà Nẵng 3 ThS. Huỳnh Ngọc Bích Thành viên Khoa Công nghệ Hóa học – Môi trƣờng, Trƣờng ĐH Sƣ phạm Kỹ Thuật- Đại học Đà Nẵng 4 TS. Lê Thị Diệu Hƣơng Thƣ ký khoa học Khoa Công nghệ Hóa học – Môi trƣờng, Trƣờng ĐH Sƣ phạm Kỹ Thuật- Đại học Đà Nẵng iii MỤC LỤC DANH SÁCH THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI i MỤC LỤC ......................................................................................... iii DANH MỤC HÌNH .......................................................................... iv DANH MỤC BẢNG BIỂU ................................................................ v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ................................................ vi THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................ vii INFORMATION ON RESEARCH RESULTS ................................ xi TÍNH CẤP THIẾT ĐỀ TÀI ............................................................... 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ĐỀ TÀI ................................................ 2 1.1. Rong biển đỏ Gracilaria ............................................................... 2 1.1.1. Giới thiệu chung ....................................................................... 2 1.1.2. Sự phân bố các loài Gracilaria .................................................. 2 1.1.3. Thành phần hóa học .................................................................. 2 1.2. R-Phycoerythrin .......................................................................... 3 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .. 4 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu .................................................................. 4 2.2. Quy trình chiết xuất R-phycoerythrin .......................................... 4 2.3. Tinh sạch R-phycoerythrin .......................................................... 4 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................. 5 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .......................................... 6 3.1. Nghiên cứu quy trình chiết xuất chất màu R-phycoerythrin ....... 6 3.1.1. Nghiên cứu chiết xuất R-PE bằng phƣơng pháp ngâm ............. 6 3.1.2. Nghiên cứu chiết xuất R-PE bằng phƣơng pháp thủy phân ...... 8 3.1.3. Tối ƣu hóa điều kiện chiết xuất bằng phƣơng pháp bề mặt đáp ứng (RSM) .......................................................................................... 8 3.2. Nghiên cứu tinh sạch R-phycoerythrin bằng phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion ........................................................................................ 11 3.3. Đề xuất quy trình chiết xuất R-phycoerythrin ........................... 14 3.3.1. Đề xuất quy trình chiết xuất R-PE bằng phƣơng pháp ngâm . 14 3.4.2. Quy trình chiết xuất R-PE bằng phƣơng pháp thủy phân ...... 14 3.5. Đề xuất quy trình tinh sạch R-PE .............................................. 15 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................... 16 iv DANH MỤC HÌNH SỐ HIỆU HÌNH TÊN HÌNH TRANG 3.1 Hàm lƣợng protein (A), R-PE (B) từ Gracilaria gracilis 8 3.2 Biểu đồ bề mặt đáp ứng năng suất R-PE (mg/g CK) theo thời gian thủy phân, tỷ lệ E/S và nhiệt độ thủy phân. A: mặt đáp ứng tƣơng tác giữa thời gian và tỷ lệ E/S; B: mặt đáp ứng tƣơng tác giữa nhiệt độ và tỷ lệ E/S; C: mặt đáp ứng tƣơng tác giữa nhiệt độ và thời gian thủy phân 10 3.3 Sắc ký đồ của dung dịch chiết thô CE1 từ Gracilaria gracilis trên cột DEAE Sepharose. Các phân đoạn rửa giải: A: AE-150/AE- 200/AE-1000; B: AE-150/AE-250/AE-1000; C: AE-150/AE-300/AE-1000 Ghi chú: Sắc ký đồ đƣợc theo dõi bằng quang phổ UV-visible tại 280nm (-------), 565nm ( ), nồng độ NaCl (). 12 3.4 Quang phổ hấp thụ, sắc ký đồ lọc gel tại phân đoạn AE-200 13 3.5 Điện di đồ các phân đoạn nhận đƣợc sau khi qua cột sắc ký trao đổi ion 13 3.6 Sơ đồ quy trình công nghệ chiết xuất R-PE bằng phƣơng pháp ngâm 14 3.7 Sơ đồ quy trình công nghệ chiết xuất R-PE bằng phƣơng pháp thủy phân 14 3.8 Sơ đồ quy trình công nghệ tinh sạch R-PE 15 v DANH MỤC BẢNG BIỂU SỐ HIỆU BẢNG TÊN BẢNG TRANG 3.1 Hàm lƣợng R-PE và chỉ số độ tinh khiết PI tại các tỷ lệ giữa nguyên liệu/dung môi nƣớc đƣợc khảo sát 6 3.2 Chất lƣợng R-PE tại các thời điểm đƣợc khảo sát 6 3.3 Hàm lƣợng R-PE, PI, protein hòa tan của Gracilaria gracilis sau khi đƣợc chiết xuất từ các dung môi khác nhau 7 3.4 Ma trận thí nghiệm theo phƣơng pháp thiết kế phức hợp trung tâm CCD (n=3). 9 3.5 Bảng tóm tắt kết quả hàm lƣợng R-PE, chỉ số độ tinh khiết R-PE thu đƣợc từ rong biển sấy Gracilaria gracilis 10 3.6 Hàm lƣợng R-PE và PI của dịch chiết thô (CE) của Gracilaria gracilis và các phân đoạn sau khi tinh sạch 13 vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT R-PE: R-phycoerythrin G.gracilis: Gracilaria gracilis G.: Gracilaria RSM: Response surface methodology CE: Crude Extract CEVA: Centre d’Étude et de Valorisation des Algues FAO: Food and Agriculture Organisation PI: Purity Index kDa: Kilo Dalton AE: Anion exchange CK: Chất khô vii ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Đơn vị: Đại học Sƣ phạm Kỹ Thuật ------- THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1. Thông tin chung: - Tên đề tài: Nghiên cứu quy trình chiết xuất chất màu tự nhiên R- phycoerythrin từ rong biển đỏ - Mã số: B2018-ĐN06-14 - Chủ nhiệm đề tài: TS. Nguyễn Hữu Phƣớc Trang - Tổ chức chủ trì: Trƣờng Đại học Sƣ phạm Kỹ Thuật - Thời gian thực hiện: 08/2018 – 07/2020 2. Mục tiêu: Nghiên cứu chiết xuất chất màu tự nhiên R-phycoerythrin từ nguồn rong biển đỏ nhằm bổ sung thêm nguồn chất màu tự nhiên cho ngành công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm. Chất màu R- phycoerythrin tinh khiết có thể sử dụng trong lĩnh vực y học và công nghệ sinh học. Nghiên cứu của đề tài tập trung vào quy trình chiết xuất chất màu tự nhiên R-phycoerythrin bằng phƣơng pháp ngâm trong dung môi và phƣơng pháp enzyme thủy phân nhằm mục đích thu nhận R-phycoerythrin đạt năng suất cao với các thông số công nghệ tối ƣu. Ngoài ra, nghiên cứu bƣớc đầu tinh sạch chất màu này bằng các phƣơng pháp khác nhau nhằm thu nhận sản phẩm R-PE tinh khiết. 3. Tình mới và sáng tạo: Nghiên cứu này đã đƣa ra đƣợc những dẫn liệu khoa học mới về ảnh hƣởng của các phƣơng pháp chiết xuất đến quá trình chiết xuất rong biển đỏ. Đồng thời cũng bƣớc đầu tinh sạch chất màu R-PE đạt đƣợc chỉ số độ tinh khiết cao. 4. Kết quả nghiên cứu: - Tiền xử lý nguyên liệu là một trong những công đoạn quan trọng của quá trình chiết xuất R-phycoerythrin. Phƣơng pháp sấy thăng hoa viii nguyên liệu và nghiền bằng nitơ lỏng mang lại hiệu quả chiết xuất R- PE cao. - Hai phƣơng pháp chiết xuất R-PE đã đƣợc nghiên cứu: sử dụng dung môi chiết xuất (nƣớc, nƣớc cất và dung dịch đệm phosphate 20 mM, pH 7,1) và sử dụng enzyme thủy phân polysaccharide (xylanase, cellulase và β-glucanase). Năng suất thu nhận R-PE từ phƣơng pháp thủy phân đạt 12.76 mg g-1 dw. - Tối ƣu hóa các điều kiện thủy phân bằng phƣơng pháp bề mặt đáp ứng tại các điều kiện (nhiệt độ (32C), thời gian (286 phút), enzyme cellulase/rong biển sấy (47 mg g-1), hàm lƣợng R-phycoerythrin thu nhận đƣợc đạt giá trị 15.75 mg g-1 dw. - R-phycoerythrin tinh khiết thu đƣợc với chỉ số độ tinh khiết cao (A565/A280) đạt 3.25 (chỉ số độ tinh khiết tiêu chuẩn = 3.2) sau khi tinh sạch bằng phƣơng pháp sắc ký với cột DEAE Sepharose với phân đoạn thu nhận tại nồng độ muối NaCl 200 mM. 5. Sản phẩm: 5.1. Sản phẩm khoa học + 01 Bài báo trên Tạp chí Quốc tế thuộc danh mục SCI: Purification of R-phycoerythrin from a marine macroalga Gracilaria gracilis by anion-exchange chromatography (2020). Huu Phuoc Trang Nguyen, Michèle Morançais, Paul Déléris, Joël Fleurence, Chau Thanh Nguyen-Le, Khanh Ha Vo, Justine Dumay. Journal of Applied Phycology, 32, 553–561. + 01 Bài báo đăng kỷ yếu hội thảo quốc tế: 4th International Conference on Green Technology and Sustainable Development (GTSD 2018). Extracting and purifying pigment R-phycoerythrin from the red alga Mastocarpus stellatus”. Tác giả: Huu Phuoc Trang Nguyen, Michèle Morançais, Joël Fleurence, Thi Ngoc Linh Tran, Justine Dumay. 4th International Conference on Green Technology and Sustainable Development (GTSD 2018), 573-578. + 01 Bài báo đăng kỷ yếu hội thảo quốc gia: Hội thảo khoa học quốc gia “Ứng dụng công nghệ mới trong công trình Xanh (AtiGB 2018). ix Nghiên cứu tối ƣu hóa các điều kiện thủy phân đến quá trính thu nhận R-phycoerythrin từ Gracilaria gracilis. Tạp chí Khoa học Công nghệ, Đại học Đà Nẵng 11(132).2018, Quyển 2; Trang: 166- 170. 5.2. Sản phẩm ứng dụng + 100 ml mẫu R-phycoerythrin từ rong biển đỏ + 01 Qui trình chiết xuất chất màu tự nhiên R-phycoerythrin từ rong biển đỏ. Cung cấp đầy đủ các công đoạn và thông số kỹ thuật đƣợc Hội đồng Khoa chuyên ngành thông qua. 6. Phƣơng thức chuyển giao, địa chỉ ứng dụng, tác động và lợi ìch mang lại của kết quả nghiên cứu: 6.1 Phƣơng thức chuyển giao Khoa Công nghệ Hóa học – Môi trƣờng, Trƣờng Đại học Sƣ Phạm Kỹ Thuật, Đại học Đà Nẵng 6.2. Địa chỉ ứng dụng Có thể chuyển giao công nghệ cho các cơ sở chế biến thực phẩm, mỹ phẩm, dƣợc phẩm trong nƣớc. 6.3. Tác động và lợi ích mang lại của kết quả nghiên cứu + Đối với lĩnh vực giáo dục và đào tạo Đề tài áp dụng công nghệ hiện đại, thiết bị tiên tiến nhƣ công nghệ nghiền nhỏ nguyên liệu bằng nitơ lỏng, thiết bị sấy thăng hoa, tinh sạch chất màu R-phycoerythrin bằng thiết bị sắc ký trao đổi ion, sắc ký lọc gel + Đối với lĩnh vực khoa học và công nghệ có liên quan - Đề tài có thể đƣợc sử dụng làm tài liệu tham khảo về các phƣơng pháp nghiên cứu chiết xuất chất màu tự nhiên R-phycoerythrin theo các phƣơng pháp khác nhau nhƣ phƣơng pháp chiết bằng dung môi, thủy phân enzyme. - Tăng số lƣợng bài báo công bố trong nƣớc và quốc tế cho ĐHĐN. + Đối với phát triển kinh tế-xã hội - R-PE thu nhận từ rong biển có thể sử dụng thay thế chất màu tổng hợp, ứng dụng trong ngành chế biến thực phẩm, mỹ phẩm. - Đa dạng hóa sản phẩm thu nhận từ rong biển. x xi INFORMATION ON RESEARCH RESULTS 1. General information: Project title: Study on extraction process of R-phycoerythrin from red seaweed Code number: B2018-ĐN06-14 Coordinator: Nguyễn Hữu Phƣớc Trang Implementing institution: University of Technology and Education Duration: from 08/2018 to 07/2020 2. Objective(s): This research reports an effective procedure for the extraction of R- phycoerythrin from red seaweed. R-phycoerythrin has been used in food, cosmetics, pharmaceuticals and analytical reagents. Two different methods for the extraction of this pigment were tested: using the extraction solutions and using polysaccharide-degrading enzymes. Besides, the present research aims to purify the R- phycoerythrin by one-step anion-exchange chromatography. 3. Creativeness and innovativeness: This research presented different methods for the extraction and purification of R-phycoerythrin from red seaweed. The purity of the R-phycoerythrin obtained from G. gracilis reached 3.25 by anion- exchange chromatography after a three-step increasin gradient of salt concentration. This method reduced the number of processing steps for purification of R-PE and the processing time. 4. Research results: - The algae pretreatment is an important stage, and the highly effective extraction of R-phycoerythrin from Gracilaria gracilis was carried out with freeze-dried seaweed and grinding with liquid nitrogen. - Two different methods for the extraction of this pigment were tested: using the extraction solutions (tap water, pure water and phosphate buffer 20 mM, pH 7,1) and using polysaccharide-degrading enzymes (xylanase, cellulase and β-glucanase). The latter, especially cellulase, enhanced the extraction yield of R-phycoerythrin from Gracilaria gracilis (12.76 mg g -1 dw). Finally, under the optimal hydrolysis xii conditions obtained for the enzyme cellulase according to a response surface methodology study (temperature (32C), hydrolysis time (286 min), enzyme/dry seaweed ratio (47 mg/g CK dw), the maximum yield of R-phycoerythrin reached 15.75 mg/g CK dw. - Native R-phycoerythrin was achieved with a high purity index (A565/A280 ratio) of 3.25 (3.2 = standard R-phycoerythrin purity) after purification on DEAE Sepharose fast flow chromatography with the obtained fraction at 200 mM NaCl. 5. Products: 5.1. Scientific products + A research paper was published in SCI journal: Purification of R-phycoerythrin from a marine macroalga Gracilaria gracilis by anion-exchange chromatography (2020). Huu Phuoc Trang Nguyen, Michèle Morançais, Paul Déléris, Joël Fleurence, Chau Thanh Nguyen-Le, Khanh Ha Vo, Justine Dumay. Journal of Applied Phycology, 32, 553–561. + A research paper was published in the 4th International Conference on Green Technology and Sustainable Development (GTSD 2018). Extracting and purifying pigment R-phycoerythrin from the red alga Mastocarpus stellatus”(2018). Huu Phuoc Trang Nguyen, Michèle Morançais, Joël Fleurence, Thi Ngoc Linh Tran, Justine Dumay. 4th International Conference on Green Technology and Sustainable Development (GTSD 2018), 573-578. + A research paper was published in the 4th National Scientific Conference on Applying New Technology in Green Buildings (AtiGB 2018). Optimization of hydrolysis conditions to obtain R-phycoerythrin from Gracilaria gracilis (2018). Nguyễn Hữu Phƣớc Trang. Journal of Science and Technology, 11(132), 166-170. 5.2. Other products + 100 ml R-phycoerythrin + An extraction process of R-phycoerythrin from red seaweed. 6. Transfer alternatives, application institutions, impacts and benefits of research results: xiii 6.1 Transfer alternatives The Faculty of Chemical Technology – Environment, University of Technology and Education, University of Danang. 6.2. Application institutions The research results are able to be transfered to the food processing facility, cosmetics and pharmaceuticals. 6.3. Impacts and benifits of research results + Educational and training efficiency This research was applied the modern equipements and methods: freeze-dried, grinding with liquid nitrogen, anion-exchange chromatography, gel filtration,... + Field of science and technology - The information from research results is valuable references resource for extraction process of R-phycoerythrin by different methods. - Increasing the research paper for University of Danang + Economic and social efficiency - R-PE from red seaweed could be used in food and cosmetic - Diversify products from red seaweed - The research results are able to be transfered to the food processing facility, cosmetics and pharmaceuticals. + University of Technology and Education, University of Danang - Increasing the research paper for University of Technology and Education, University of Danang. -The information from research results is valuable references resource for teaching theory as well as the practice of relevant modules in Food Technology. 1 TÍNH CẤP THIẾT ĐỀ TÀI Rong biển chứa nhiều thành phần dinh dƣỡng tốt cho cơ thể và giá trị dinh dƣỡng cao hơn. Rong biển là nguồn giàu khoáng chất cần thiết nhƣ magie, canxi, đồng, kali, selen, kẽm, iốt, sắt và chứa lƣợng rất thấp các chất béo. Rong biển cũng chứa nhiều chất chống oxy hóa, protein thực vật và hàm lƣợng chất xơ phong phú cần thiết cho cơ thể. Vitamin có trong rong biển là vitamin A, B, C, E và K. Rong biển cũng có chứa các axit béo omega-3 và tất cả các axit amin quan trọng cần thiết cho cơ thể con ngƣời. Ở Việt Nam, rong biển hiện nay chủ yếu khai thác từ nguồn lợi tự nhiên, sản lƣợng nuôi trồng không nhiều, chủ yếu tập trung vào nhóm rong đỏ chiết xuất agar, carrageenan nhƣ Gracilaria (Rhodophyta, Gigartinales), Kappaphycus alvarezzi (Rhodophyta, Gigartinales) và Kappaphycus striatum (Rhodophyta, Gigartinales). Gracilaria gracilis đã đƣợc nghiên cứu và báo cáo là nguồn nguyên liệu chứa nhiều hợp chất có giá trị với các ứng dụng nhƣ: polyme agar đƣợc sử dụng làm vật liệu mao quản và mẫu sinh học trong sản xuất hạt nano, sản xuất protein cho công nghiệp thực phẩm . R-phycoerythrin (R-PE) là phycobiliprotein chính trong rong biển đỏ. Cấu trúc tiểu đơn vị của R-PE phổ biến nhất là (αβ)6γ, khối lƣợng phân tử khoảng 240.000 Da. R-PE hiện đang đƣợc sử dụng trong sản xuất thực phẩm và mỹ phẩm nhƣ chất tạo màu tự nhiên. Nó cũng thƣờng đƣợc sử dụng nhƣ một phần trong chuyển giao năng lƣợng huỳnh quang, trong miễn dịch học và lƣu lƣợng tế bào. R-PE có thể đƣợc chiết xuất bằng nhiều phƣơng pháp khác nhau nhƣ phƣơng pháp ngâm nguyên liệu trong dung môi hay chiết xuất bằng phƣơng pháp thủy phân nhờ các enzyme polysaccharides. Nghiên cứu chiết xuất R-PE từ rong biển đỏ Gracilaria gracilis là đề tài với mục đích nghiên cứu các phƣơng pháp chiết xuất R-PE nhằm nâng cao năng suất thu hồi R-PE đồng thời bƣớc đầu nghiên cứu tinh sạch chất màu này nhằm tăng giá trị sử dụng. 2 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ĐỀ TÀI 1.1. Rong biển đỏ Gracilaria 1.1.1. Giới thiệu chung Gracilaria là một trong những chi lớn của rong biển đỏ Rhodophyta, với hơn 150 loài đã đƣợc công bố (Byrne et al. 2002), có giá trị kinh tế quan trọng nhƣ nguồn cung cấp agar, nguồn thức ăn cho con ngƣời và các loài động vật giáp xác (Armisen 1995). Chi Gracilaria thuộc ngành rong đỏ, tuy nhiên các loài của chi này lại tồn tại nhiều màu sắc khác nhau bao gồm: đen, vàng, xanh và đỏ. Những loài rong biển này có thể thay đổi màu sắc phụ thuộc vào thành phần sắc tố của chúng, do chịu ảnh hƣởng từ nguồn ảnh sáng (Ramus et al. 1983), thời gian trong năm, vị trí địa lý (Paul et al. 2014), sự phối hợp giữa các loài rong biển có màu sắc khác nhau (Plastino et al. 1999) hay màu sắc của chúng bị biến tính (Marevita 2013). 1.1.2. Sự phân bố các loài Gracilaria Các loài rong biển đỏ Gracilaria hầu nhƣ phân bố trên toàn thế giới vì nó có khả năng chịu đƣợc sự biến đổi sinh thái lớn (Hình 1.8) (Perez et Barbaroux 2016). Chúng có thể đƣợc tìm thấy tại các vùng biển từ vĩ độ 600 bắc, 400 nam và vùng nƣớc lạnh (Kling 1978). Theo FAO, tổng thu hoạch các loài Gracilaria vào năm 2011 trên thế giới đạt khoảng 2.257.919 tấn, đạt 3.538.655 tấn vào năm 2014. Các loài Gracilaria thƣờng đƣợc nuôi trồng phổ biến tại Trung quốc (1.513.590 tấn) và Đài Loan (khoảng 4.865 tấn). Các loài này 94,2% (khoảng 697.240 tấn) đƣợc thu hoạch từ nuôi trồng, phần còn lại (42.224 tấn) từ nguồn tự nhiên. Các nƣớc nuôi trồng các loài Gracilaria hiện nay tại châu Mỹ nhƣ Chilê, Peru, Argentine, tại châu Á bao gồm Trung quốc, Đài loan, Indonesia, Vietnam, Philipin, Hàn quốc. 1.1.3. Thành phần hóa học Gracilaria có khoảng hơn 300 loài, trong đó 160 loài đã đƣợc định danh (Francavilla et al. 2013). Các loài này mang lại giá trị kinh tế quan trọng trong công nghiệp và công nghệ sinh học (Capo et 3 al. 1999). Qua các tài liệu tham khảo cho thấy, hàm lƣợng protein của các loài Gracilaria dao động từ 5,2% đến 45% tùy theo loài. Trong nghiên cứu này, chúng t