Cơ chế và hiệu ứng của phản ứng thủy phân và oxy hóa dưới xúc tác của Enzyme

LỜI MỞ ĐẦU Enzyme là những chất xúc tác hữu cơ có tính đặc hiệu cao đối với cơ chất do tế bào sống tổng hợp nên, điều khiển vận tốc và sự chuyển hóa của hàng ngàn phản ứng hóa học xảy ra trong sinh chất. Với những ưu điểm như có nguồn gốc từ tự nhiên nên ít tác hại đối với cơ thể, điều kiện xúc tác phản ứng ôn hòa, và có thể chiết tách được từ nhiều nguồn nguyên liệu phổ biến trong tự nhiên… mà ngày nay Công nghệ enzyme rất phát triển và được ứng dụng rộng rãi trong đời sống. Enzyme có 6 lớp, trong đó enzyme thủy phân và enzyme oxy hóa khử được ứng dụng đại trà nhất. Đặc biệt trong công nghiệp chế biến thực phẩm, chúng được ứng dụng để tạo ra mùi vị và màu sắc đặc trưng cho sản phẩm, giúp thời gian sản xuất rút ngắn... Tuy nhiên, bên cạnh những ưu điểm trên, những enzyme này cũng gây ra không ít bất lợi cho quá trình chế biến và bảo quản, làm ảnh hưởng đến chất lượng và cảm quan của sản phẩm thực phẩm. Vì vậy, chúng ta cần phải nắm rõ cơ chế phản ứng và hiệu ứng của chúng để có những điều chỉnh phù hợp về điều kiện sản xuất, bảo quản…nhằm đạt được hiệu quả cao nhất khi ứng dụng vào sản xuất và cả trong chiết tách enzyme. Những ứng dụng và những thông tin trên rất cần thiết cho việc mở rộng kiến thức, nghiên cứu, ứng dụng vào thực tiễn . Đó cũng là nội dung chúng em sẽ trình bày trong đề tài tiểu luận : Cơ chế và hiệu ứng của phản ứng thủy phân và oxy hóa dưới xúc tác của Enzyme TỔNG QUAN VỀ ENZYME Bất kỳ lúc nào trong cơ thể sống cũng có hàng trăm phản ứng hóa học xảy ra. Các phản ứng này cung cấp năng lượng và duy trì sự cung cấp rất nhiều chất cần thiết cho tăng trưởng và tái tạo. Ở đây, các phản ứng điều phối toàn bộ quá trình chuyển hóa có được là nhờ vào sự sản xuất các chất đặc biệt, gọi là enzyme (trong tiếng Hy lạp en là bên trong, zym là sự lên men). Đa số các enzyme có bản chất hóa học là protein, một số khác có bản chất là acid nucleic (trong trường hợp ở viruts) có khả năng điều hòa, xúc tác cho các phản ứng sinh hóa nên còn được gọi là các xúc tác sinh học. TÍNH CHẤT SINH HỌC CỦA ENZYME Không tham gia vào thành phần cuối của phản ứng Chỉ làm tăng nhanh phản ứng mà các phản ứng này có thể xảy ra ở điều kiện không có enzyme Không làm mất vị trí cân bằng của phản ứng mà chỉ làm tăng tốc độ của phản ứng Theo cấu trúc hóa học thì tất cả enzyme là protein Có hiệu suất xúc tác sinh học cao hơn gấp nhiều lần xúc tác hóa học, tuy nhiên vận tốc có thể tăng khi có xúc tác hóa học Enzyme có tính đặc hiệu cao và có tính chọn lọc đối với cơ chất Thực hiện sứ mệnh điều phối tất cả các quá trình trao đổi chất của cơ thể Trong các phản ứng enzyme hầu như kết quả cho ra 100% sản phẩm BẢN CHẤT HÓA LÝ CỦA ENZYME Có tính chất lý hóa học của protein Đa số có dạng hình cầu và không đi qua được màng bán thấm do kích thước lớn Tan tốt trong nước và trong dung dịch muối loãng (buffer) Cũng như protein enzyme không bền với nhiệt độ. Bị biến tính không thuận nghịch bởi acid, base mạnh hay muối kim loại nặng Enzyme là những protein đơn giản (enzyme 1 cấu tử): chỉ cấu tạo bởi các L-amino acid, trung tâm hoạt động là các nhóm chức có trong phân tử của amino acid Enzyme phức tạp (enzyme 2 cấu tử): ngoài L-amino acid còn có nhóm ngoại (prosthetic). Trong enzyme phức tạp, phần protein gọi là apoenzyme, phần không phải protein có thể tách ra và tồn tại độc lập gọi là coenzyme (vitamin). Khi kết hợp chặt với phần protein gọi là nhóm ngoại Đa số các coenzyme là chất cho hoặc nhận điện tử Coenzyme trực tiếp tham gia trong phản ứng xúc tác và giữ vai trò quyết định kiểu của phản ứng xúc tác Coenzyme là cầu nối giữa phần protein của enzyme và giúp ổn định phần apoenzyme Ngược lại apoenzyme có tác dụng nâng cao hiệu lực xúc tác của coenzyme và quyết định tính đặc hiệu của enzyme TÍNH ĐẶC HIỆU Đặc hiệu phản ứng: Một enzyme chỉ xúc tác cho một phản ứng. Đặc hiệu cơ chất: Đặc hiệu tuyệt đối: chỉ có tác dụng lên một cơ chất nhất định Đặc hiệu tương đối: có khả năng tác dụng lên một kiểu nối hóa học nhất định trong phân tử cơ chất. Đặc hiệu nhóm: có khả năng tác dụng lên một kiểu nối hóa học. Đặc hiệu quang học (còn gọi là đặc hiệu lập thể): chỉ tác dụng lên những đồng phân lập thể nhất định. IV. PHÂN LOẠI ENZYME Phân loại theo cấu tạo: Enzyme một thành phần: Chỉ có thành phần cấu tạo duy nhất là protein. Enzyme hai thành phần: Một phần là protein được kết hợp với một thành phần khác. - Thành phần cấu tạo bởi protein gọi là Apoenzyme. Quyết định tính đặc hiệu cơ chất. - Thành phần không cấu tạo bởi protein, mà có khả năng tách ra gọi là Coenzyme. Quyết định tính đặc hiệu phản ứng. - Thành phần không cấu tạo bởi protein, mà không thể tách ra gọi là Cofacter. 2. Phân loại theo kiểu phản ứng: Enzyme được phân loại thành 6 nhóm chính: Oxidoreductase Transferase Hydrolase Lyase Isomerase Ligase 2.1. Oxidoreductase Là nhóm xúc tác cho các phản ứng oxy hóa khử Nếu chất chuyển hay chất nhận rõ ràng thì gọi tên theo chúng. Ex. Dehydrogenase (NAD, FAD, FMN,…) oxydase (nhận hydro), oxygenase (kết hợp trực tiếp với oxy) Nếu chất cho hydro không rõ ràng thì gọi là reductase Các enzyme thường gặp trong nhóm này là: dehydrogenase, oxydase, peroxidase, catalase,… 2.2. Transferase Là nhóm enzyme xúc tác chuyển nhóm, chuyển gốc từ chất này sang chất khác Phản ứng tổng quát là AX + B à A + BX Cách gọi tên: theo chất nhận nhóm chuyển vận transferase E.C. Number Tên và các nhóm phụ xúc tác 2 2.1 2.1.1 2.1.2 2.1.3 2.2 2.3 2.4 2.6 2.6.1 2.7 2.7.1 Transferases (transfer of functional groups) Transferring C-1 groups Methyltransferases Hydroxymethyltransferases and formyltransferases Carboxyltransferases and carbamoyltransferases Transferring aldehydic or ketonic residues Acyltransferases Glycosyltransferases Transferring N-containing groups Aminotransferases Transferring P-containing groups With an alcohol group as acceptor 2.3. Hydrolase Là nhóm enzyme xúc tác các phản ứng thủy phân các hợp chất hữu cơ với sự tham gia của nước Phản ứng tổng quát XY + H2O à XOH + YH Cách gọi tên: Tên của cơ chất được tách ra hydrolase Các enzyme thường gặp là esterase, phosphatase, nuclease, peptidase, lipase 2.4. Lyase Là enzyme phân cắt chất hữu cơ không có sự tham gia của nước Cách gọi tên: tên cơ chất + tên của nhóm được tách ra + lyase. Ex. Aspactate ammonia lyase Các enzyme thường gặp: decarboxylase, aldolase, hydratase,… 2.5. Isomerase Là nhóm enzyme xúc tác cho chuyển hóa giữa 2 dạng đồng phân D và L, cis và trans, aldose và ketose Các enzyme thường gặp là epimerase, mutase, isomerase 2.6. Ligase Là nhóm enzyme xúc tác tổng hợp chất hữu cơ và cần năng lượng từ ATP, GTP,… Được chia thành 4 phụ nhóm tạo các liên kết: - C – O -, - C – S-, - C – N -, - C – C – Cách gọi tên: Tên cơ chất + ligase (hay synthetase); VD: Glutamin synthetase CẤU TRÚC CỦA ENZYME Trong cấu trúc của enzyme tồn tại trung tâm họat động. Đây là phần rất nhỏ của enzyme, nhưng nó lại quyết định tính xúc tác, tính đặc hiệu của enzyme. Một trung tâm hoạt động của enzyme gồm 2 vùng: Tâm xúc tác: Tham gia kết hợp trực tiếp với cơ chất Miền tiếp xúc: Gắn cơ chất lên vị trí tác dụng Đối với enzyme một thành phần, trung tâm hoạt động của enzyme được hình thành do sự tương tác lẫn nhau của một số gốc acid amin nhất định có trong cấu trúc của enzyme. Đối với enzyme hai thành phần, trung tâm hoạt động thường là các nhóm ngoại như vitamin, ion kim loại,...và các nhóm định chức của acid amin ở phần apoenzyme. CƠ CHẾ HOẠT ĐỘNG CỦA ENZYME Mô hình chìa khóa và ổ khóa: Trung tâm hoạt động phải có cấu trúc tương ứng với cấu trúc của cơ chất (khớp với nhau như chìa và ổ khóa) Thuyết tiếp xúc cảm ứng: (theo Kosland) sự tương tác cảm ứng về cấu trúc không gian tạo nên phức hợp enzyme cơ chất Năng lượng hoạt hóa (Ea): Là năng lượng cần cung cấp để phân tử đạt tới trạng thái hoạt hóa. VD: Xăng có khả năng bốc cháy nhưng cần lửa mồi. Cơ chế tổng quát: Cơ chất phải được gắn vào trung tâm hoạt động của enzyme tạo thành phức hợp enzyme – cơ chất [ES] Với tác dụng của enzyme, hoạt tính của cơ chất tăng lên rõ rệt và chỉ cần 1 năng lượng hoạt hóa nhỏ thì sẽ tạo thành sản phẩm Cơ chế tác dụng theo Michaelis-Menten Tạo nhanh phức ES, phức này không bền, phức được tạo nên do các liên kết hóa học Dưới tác dụng của enzyme, cơ chất được biến đổi thành sản phẩm Sau khi tạo sản phẩm (P), enzyme được giải phóng ra và trở về trạng thái ban đầu Phản ứng tổng quát: E + S D ES D ES* " EP " E + P CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN VẬN TỐC PHẢN ỨNG Nồng độ enzyme Nồng độ cơ chất Nhiệt độ pH Chất hoạt hóa Chất kìm hãm CƠ CHẾ & HIỆU ỨNG CỦA PHẢN ỨNG THỦY PHÂN VÀ PHẢN ỨNG OXY HÓA DƯỚI XÚC TÁC CỦA ENZYME ENZYME THỦY PHÂN I. Hệ enzym thủy phân (hydrolase) Tính chất chung của nhóm enzym này là xúc tác các phản ứng thủy phân, nghĩa là phân giải các hợp chất phức tạp với sự tham gia của nước, thành những hợp chất đơn giản hơn. Các hyddrolase phần lớn là các enzym một thành phần nên chúng không cần coenzym cho hoạt động xúc tác. Trung tâm hoạt động của chúng bao gồm tổ hợp các nhóm định chức của axit amin không tham gia tạo thành trục chính của sợi polypeptit. Các nhóm định chức có thể ở xa nhau trong mạch polypeptit nhưng lại gần nhau trong không gian, được định hướng xác định trong không gian cách nhau những khoảng cách nhất định sao cho chúng có thể tương tác với nhau trong quá trình xúc tác. Nhóm hyddrolase ( EC3) được chia thành 11 phân nhóm sau: 3.1 : enzym thủy phân các liên kết ester 3.2 : enzym thủy phân các liên kết glycoside 3.3 : enzym thủy phân các liên kết eter 3.4 : enzym thủy phân các liên kết peptide 3.5 : enzym thủy phân các liên kết C—N không phải peptide (các amide) 3.6 : enzym thủy phân các liên kết anhydride acid 3.7 : enzym thủy phân các liên kết C—C 3.8 : enzym thủy phân các liên kết haloid – rượu 3.9 : enzym thủy phân các liên kết P—N 3.10 : enzym thủy phân các liên kết S—N 3.11 : enzym thủy phân các liên kết C—P II. Cơ chế tác dụng của enzym hydrolaza Sự khuyết electron trong liên kết bị thủy phân là yếu tố quan trọng quyết định khả năng và sự dễ dàng của phản ứng thủy phân. Tác dụng xúc tác của enzym phụ thuộc vào từng trường hợp và do sự phân bố electron đã tồn tại trước đó quyết định. Enzym có thể tác dụng bằng các cách khác nhau. Cơ chế đơn giản nhất cho phép liên hệ "phần dương" của liên kết bị thủy phân với tác dụng của enzym là: tâm ái nhân của enzym sẽ tương tác trực tiếp với một trong hai nguyên tử tích điện dương của liên kết bị thủy phân. Sự tạo thành phức hợp trực tiếp như thế với trung tâm phản ứng sẽ làm cho sự đứt các liên kết và sự thủy phân được dễ dàng, thuận lợi. Enzym colinesteraza và nhiều esteraza khác đều tác dụng thủy phân cơ chất theo cơ chế này. Một cơ chế khác liên hệ tính tác dụng của enzym với sự khuyết electron của liên kết bị thủy phân là: enzym làm tăng sự khuyết electron vốn đã tồn tại trước đó bằng cách tạo thành liên kết tương ứng với cơ chất ở những vị trí ít nhiều gần gũi với liên kết bị thủy phân. Nhờ vậy ,làm cho sự phân bố electron trong phân tử cơ chất bị thay đổi theo một chiều hướng cần thiết, khiến cho việc đứt liên kết được dễ dàng hoặc khiến cho một trong hai nguyên tử của liên kết tương tác được với các tác nhân ái nhân. III. Đặc điểm chung của trung tâm hoạt động của enzyme thủy phân Đa số enzyme thủy phân (hydrolase) không có nhóm ngoại. Như vậy bắt buộc tâm hoạt động của chúng phải có các gốc axitamin đặc hiệu. Tâm hoạt động của enzyme hydrolase thường chứa nhóm imidazol của histidin và nhóm hydroxyl của một trong số các gốc serin. Nhiều hydrolase, người ta đã biết được thứ tự sắp xếp của các axitamin chung quanh tâm hoạt động: Kimotripxin A — Gly — Asp — Ser — Gly — Tripxin — Gly — Asp — Ser — Gly — Trombin — Asp — Ser — Gly — Kimotripxin — Asp — Ser — Gly — Colinesteraza — Gly — Glu — Ser — Ala — Carboxylesteraza — Gly — Glu — Ser — Ala — IV. Đặc điểm của các cơ chất bị enzyme thủy phân Các cơ chất được enzyme thủy phân thường là protein, gluxit, lipit .v.v.. Theo Bernard Pullman và Alberte Pullman, đặc điểm chung của những cơ chất này là có "liên kết bị thủy phân" do các nguyên tử tích điện dương tạo nên. Người ta gọi các liên kết này là "liên kết nhị dương". Chẳng hạn, liên kết peptit trong protein: O R1 C N R2 H Liên kết này do các electron s định vị của liên kết đơn và một hệ thống eletron p linh động tạo nên. Hệ thống đó gồm bốn electron trong đó hai electron của nối kép C = O và hai electron của cặp không chia của nitơ. Bốn electron này tạo thành một hệ thống cộng hưởng và theo qui tắc chung: khi ở nguyên tử dị mạch nằm kề liền với nối kép có cặp electron không chia thì sẽ xảy ra sự chuyển dịch một phần điện tích của cặp không chia từ nguyên tử dị mạch tới nguyên tử cuối của nối kép. Như vậy, sự phân bố điện tích trong liên kết peptit có thể như sau: O- R1 C- N+ R2 H Khi đó nguyên tử nitơ tích điện dương, nghĩa là thay cho hai electron của cặp không chia, nó sẽ chỉ giữ lại một phần nào đó của hai electron này thôi. Ngoài ra do sự khác nhau về độ âm điện của nguyên tử carbon và oxy của liên kết C = O, (có thể xem liên kết C = O như là sự lai hóa giữa cấu trúc đồng hóa trị C = O và cấu trúc ion C+ = O-) mà nguyên tử carbon cũng phải có điện tích tổng dương. Như vậy các nguyên tử carbon và nitơ góp vào hệ thống electron p ít hơn một electron p. Còn nguyên tử oxy góp vào hệ thống hơn một electron p, do đó có điện tích tổng âm. Nếu biểu diễn các phần điện tích đó bằng δ thì sự phân bố điện tích trong liên kết peptit như sau: -δ3 O +δ1 + δ2 R1 C N R2 H Rõ ràng δ3 = δ1 + δ2 Và (1+ δ3) + (1- δ2) + (2 - δ1) = 4. Bằng phương pháp quĩ đạo phân tử người ta đã tính được sự phân bố bốn electron của hệ thống như sau: O1.397 1.859 0.744 R1 C N R2 H Từ đây điện tích sẽ được phân bố như sau: O-0.397 +0.141 +0.25 R1 C N R2 H Thuật ngữ "liên kết nhị dương" chỉ sự khuyết electron p ở cả hai nguyên tử tạo nên liên kết đó. Đặc trưng nhị dương này của liên kết được bảo toàn trước mọi công kích bất kỳ kể cả sự tấn công của enzyme. Các liên kết nhị dương thường gặp + Liên kết este: trong este của axit carboxylic O +0.214 R1 C O R2 +0.326 Trong este của axit phosphoric O R O P O P O O Trong este của axit sulfuric: R O S este của phenol: Ph — O — R + Liên kết trong các anhidrit, đặc biệt liên kết — P — O — P trong hợp chất phosphat giàu năng lượng ATP: O O O +0.153 +0.208 +0.204 Adenine riboza O P O P O P O O+0.393 O+0.397 O+0.364 + Liên kết glucozit trong các polysacarit: Khác với các liên kết kể trên, liên kết glucozit chỉ có các electron s mà không có electron p tham gia. Trong trường hợp này, đóng vai trò phân cực là bộ electron s. Do hiệu ứng cảm ứng của nguyên tử oxy trung tâm, gây ra một sự tập trung điện tích nào đó trên nguyên tử Oxy, do đó oxy tích điện âm, còn các nguyên tử carbon kết hợp với nó bị khuyết electron nên tích điện dương. 2. Sự thủy phân bởi enzyme sẽ càng dễ dàng khi sự khuyết electron trong liên kết bị thủy phân càng lớn. Sự khuyết đó có thể được tăng lên khi tăng tổng điện tích dương của cả hai nguyên tử tạo thành liên kết hoặc khi chỉ tăng điện tích của một trong hai. Nếu trong phân tử cơ chất có nhiều liên kết giống nhau thì liên kết nào nhị dương hơn cả sẽ bị phân ly thủy phân bởi enzyme ( với điều kiện không có án ngữ không gian và đặc hiệu lập thể của từng liên kết). Chẳng hạn như trong phân tử alantoin có năm liên kết peptit, nhưng liên kết bị thủy phân trước tiên là liên kết có màu xanh như trong hình bên: O +0.121 +0.26 +0.228 H2N C NH C +0.233 C O +0.236 O N N H H +0.121 +0.124 V. Một số đặc điểm của phản ứng thủy phân bởi enzym Thứ bậc của phản ứng Sơ đồ chung của phản ứng thủy phân bởi enzym có thể biểu diễn như sau: A — B + H2O Hydrolaza AH + BOH Cơ chất + nước Enzym Sản phẩm Nhìn sơ đồ chúng ta thấy: phản ứng thủy phân bởi enzym là phản ứng lưỡng phân. Nhưng vì nồng độ của nước rất lớn coi như không thay đổi trong suốt thời gian phản ứng, do đó vận tốc của phản ứng chỉ phụ thuộc nồng độ cơ chất. Như vậy, phản ứng thủy phân bởi enzym là phản ứng đơn phân và bậc nhất. Như chúng ta đều biết, trong các phản ứng đơn phân các phân tử khởi đầu sẽ phản ứng một cách độc lập không phụ thuộc vào sự có mặt của những phân tử khác. Nếu gọi a là số phân tử gam ban đầu của cơ chất, gọi x là số phân tử gam cơ chất bị thủy phân trong khoảng thời gian từ t tới t + dt, thì x sẽ tỉ lệ với khoảng thời gian dt và số phân tử gam còn lại (a – x) chưa bị thủy phân trong thời gian t ta sẽ có: = = k(a – x) Sau một số biến đổi ta sẽ có hệ thức để tính lượng cơ chất bị thủy phân trong khoảng thời gian bất kỳ: x = a(1 – e-kt) Và hằng số vận tốc của phản ứng thủy phân bởi enzym k1: 1 = Tuy vậy trong giai đoạn đầu khi mà nồng độ của cơ chất rất lớn thì vận tốc của phản ứng coi như không thay đổi và phản ứng có thứ bậc không: Như vậy, tất cả các phản ứng thủy phân bởi enzym trong giai đoạn đầu có thứ bậc không, sau đó phản ứng có thứ bậc nhất. VI. Yếu tố điều chỉnh Đối với phản ứng thủy phân bởi enzym thì nước không những là môi trường để khuếch tán enzym và cơ chất mà còn là tác nhân tham gia vào phản ứng . Nước có ảnh hưởng không những đến vận tốc mà cả chiều hướng của phản ứng thủy phân bởi enzym . Bằng thí nghiệm trộn tinh bột đã được hồ hóa và đã sấy thăng hoa với enzym α – amilaza của vi khuẩn, sau đó đem phun hơi nước đến những độ ẩm nhất định. Người ta thấy khi hàm ẩm đạt 20% (khoảng 4% nước tự do) thì α – amilaza sẽ thủy phân tạo thành chủ yếu là glucoza và mantoza. Khi hàm ẩm cao hơn thì ngoài glucoza và mantoza còn tạo thành các oligosacarit khác. Như vậy nước cũng là một yếu tố điều chỉnh các phản ứng thủy phân bởi enzym. Có thể dùng nước làm nhân tố để tăng cường hay kìm hãm các phản ứng thủy phân có xúc tác enzym. Khoa học về bảo quản các nguyên liệu có nguồn gốc sinh học chính là dựa trên nguyên lý này. Như chúng ta đều biết, các nguyên liệu sinh học khi bảo quản có thể bị hư hỏng do một loạt các phản ứng phức tạp mà khởi đầu là phản ứng thủy phân bởi enzym. Để bảo quản được tốt thì một trong những biện pháp kĩ thuật tương ứng là tách nước bằng cách phơi, sấy .v.v. các biện pháp kỹ thuật tương ứng để tách nước trong quá trình tinh luyện dầu béo cũng là nhằm ngăn ngừa phản ứng thủy phân bởi enzym lipaza. Ngoài ra, cũng như đối với những phản ứng enzym khác, có thể dùng yếu tố nhiệt độ và pH để điều chỉnh các phản ứng thủy phân bởi enzym. Mỗi enzym thủy phân (hydrolaza) có một nhiệt độ và pH tối ưu riêng. Ngay cũng một enzym hydrolaza nhưng lấy từ các nguồn khác nhau cũng có nhiệt độ và pH xúc tác thủy phân khác nhau. Các quá trình đường hóa trong sản xuất bánh mì, trong sả