Đề tài KỸ THUẬT RAPD (RANDOM AMPLIFIED POLYMORPHIC DNA)

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG -----------o0o------------- MÔN HỌC: KỸ THUẬT DI TRUYỀN CHỦ ĐỀ: KỸ THUẬT RAPD (RANDOM AMPLIFIED POLYMORPHIC DNA) GVHD: THS. TRẦN THỊ DUNG NHÓM THỰC HIỆN: 1. BÙI MINH TRÍ 61203161 2. HUỲNH THUẬN PHÁT 61203109 3. NGUYỄN THỊ NGỌC TRINH 61203163 Giới thiệu: _ Kỹ thuật RAPD dựa trên kỹ thuật PCR, bằng cách sử dụng những primer ngắn (khoảng 10 nucleotide) có trình tự biết trước, bắt cặp và nhân bản ngẫu nhiên những đoạn DNA có trình tự bổ sung với trình tự của các primer. Theo nguyên tắc, khi 2 cá thể hoàn toàn giống nhau, sau khi thực hiện phản ứng PCR – RAPD ở điều kiện như nhau sẽ tạo ra số lượng các đoạn bằng nhau và chiều dài các đoạn tương ứng bằng nhau. _ Khi có đột biến làm xuất hiện hay mất đi một vị trí bắt cặp ngẫu nhiên sẽ tạo ra số lượng và chiều dài các đoạn DNA khác nhau giữa các cá thể, vì vậy kỹ thuật RAPD có thể phát hiện đột biến. Một trong những giới hạn của PCR chuẩn đối với ALP marker là mọi thông tin về chuỗi mã di truyền đầu tiên phải được biết rõ trước khi chuẩn bị các primer 23 tương ứng. _ Vì thế, việc áp dụng nó để nghiên cứu DNA genome của một giống cây trồng mới sẽ gặp nhiều khó khăn. Vào đầu thập kỷ 90, một kỹ thuật phân tử mới dựa trên nguyên tắc PCR với tên gọi là RAPD (Random amplified polymorphic DNA) đã ra đời một cách độc lập tại hai phòng thí nghiệm khác nhau (William, 1990; Welsh và ctv., 1991). Hình ảnh một trong các bước thực hiện phương pháp RAPD (PCR) Nguyên lý: _ Về cơ bản kỹ thuật RAPD được thực hiện theo ba bước: Tách chiết DNA tổng số, nhân DNA bằng máy PCR; điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamid; xác định tính đa dạng di truyền bằng các phần mềm thông dụng (NTSYSpc, UPGMA cluster, Gelcompar, lập dendrogram) Hình ảnh của kỹ thuật PCR _ Kỹ thuật này cho phép phát hiện tính đa hình các đoạn DNA được nhân bản ngẫu nhiên bằng việc dùng một primer chứa một trật tự nucleotide ngẫu nhiên. Thường primer này chứa từ 9 - 12 oligonucleotit, tối thiểu là 4 bp. Có hàng ngàn loại primer chứa khoảng 10 bp nhưng số lượng primer dùng trong nghiên cứu này rất hạn chế. _ Trong phản ứng này, các primer đơn gắn vào hai điểm khác nhau ở hai mạch đơn đối diện của DNA khuôn. Nếu các điểm gắn primer nằm trong khoảng có thể nhân bản được (thường 200 - 2000 nucleotide) thì đoạn DNA sẽ được nhân lên. _ Sự có mặt của sản phẩm này được quan sát thông qua điện di trên gel agarose hoặc polyacrylmide đã chứng tỏ có sự tương đồng hoàn toàn hay một phần giữa DNA genome với các primer oligonucleotide. Các primer dùng trong RAPD có kích thước ngắn nên dễ tìm được các đoạn tương đồng trên các mạch đơn DNA trong genome. Vì thế, nó là một phương pháp có hiệu quả để xác định tính đa hình về trật tự nucleotide giữa các cá thể 24. Ví dụ: tần số tìm thấy sự đa hình RAPD là 0,3 / 1 primer ở cây Arabidopsis thaliana là 0,5 / 1 primer ở cây đậu tương, 1 / 1 primer ở ngô. Các ưu điểm và nhược điểm của kỹ thuật RAPD: Ưu điểm: _ Về mặt kỹ thuật: + Kỹ thuật RAPD dễ thực hiện và dễ thành công do không cần biết trước trình tự bộ gene của đối tượng cần nghiên cứu. + Thao tác đơn giản. + Chất lượng DNA khuôn không cần độ tinh sạch cao. + Thời gian thực hiện nhanh. Khả năng nhân bản cao. _ Về mặt kinh tế: + Chi phí thực hiện thấp. + Kỹ thuật RAPD thường được sử dụng kết hợp với những kỹ thuật cao cấp khác để đánh giá đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị phân tử có độ tin cậy cao _ Chỉ thị RAPD không cần biết trước trình tự nuleotide của đoạn DNA cần khuếch đại, quy trình tiến hành nhanh, dễ làm, ít tốn kém, cho đa hình cao, tiến hành chỉ với một lượng nhỏ DNA tính bằng nanogam và trên một số lượng mẫu thí nghiệm lớn. _ Đồng thời RAPD không dùng chất phóng xạ để phát hiện đa hình. Do đó RAPD thường dùng trong phân tích và xác định mối quan hệ thân thuộc giữa các thứ cây trồng hay giữa các cá thể để phục vụ công tác lai tạo hoặc phân loại. _ Để nghiên cứu sự đa dạng di truyền bằng chỉ thị RAPD có thể tiến hành với các bước như sau: + Tách chiết DNA tổng số, nhân DNA bằng máy PCR. + Điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamid. + Xác định tính đa dạng di truyền bằng các phần mềm thông dụng (NTSYS-pc, UPGMA cluster.). Ngoài những ứng dụng trong nghiên cứu sự đa đạng sinh học và nguồn gốc di truyền của các loài động vật, thực vật và vi sinh vật, chỉ thị RAPD cũng được sử dụng cho những mục đích sau: + Lập bản đồ liên kết, xác định những gen liên kết với một tính trạng nào đó như tính trạng chất lượng sợi ở cây bông, tính trạng kháng virus ở cà. + Phân tích cấu trúc di truyền của quần thể. + In dấu vân tay (DNA fingerprinting). + Phát hiện sự khác biệt trong các dòng soma (Somaclonal variation). Nhược điểm: _ Tuy có nhiều ứng dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền nhưng chỉ thị RAPD cũng có một số hạn chế như sau: + Có tính trội (dominant) do đó khó phân biệt được những gen lặn hay cá thể dị hợp tử. + Có tính chất ngẫu nhiên nên sản phẩm PCR thường không thống nhất. + Cần phải có các thiết bị điện toán để xử lý số liệu. + Độ tin cậy còn tuỳ thuộc vào kỹ thuật cá nhân. _ Kỹ thuật RAPD có độ chính xác không cao. _ Không ổn định (thể hiện ở mức độ lặp lại giống nhau thấp). _ Khả năng nhân bản trong phản ứng PCR cao nhưng khả năng xuất hiện đa hình thấp _ Khả năng nhận diện chỉ thị phân tử thấp và có độ tin cậy không cao. Những khác biệt của RAPD với PCR: _ Do tính chất ghép cặp ngẫu nhiên nên primer vừa là primer xuôi vừa là primer ngược. _ RAPD không cho băng nhân bản nếu: + Không có trình tự nu giống trình tự primer trong genom của đối tượng nghiên cứu. + Có các trình tự này nhưng lại cũng nằm trên một sợi hay các trình tự nằm ở hai sợi quá xa nhau hay khi ghép cặp các primer không hướng vào nhau. _ Phải sử dụng nhiều primer khác nhau mới có thể phát hiện được những đa hình hay các khác biệt của genom của đối tượng nghiên cứu. _ Có thể dùng phối hợp vài primer cùng một phản ứng để tăng số băng nhân bản. Ứng dụng: _ Ứng dụng của kỹ thuật RAPD Kỹ thuật RAPD được phát minh và sử dụng ngay sau khi kỹ thuật PCR ra đời, mặc dù cho kết quả có độ tin cậy không cao nhưng vẫn còn được sử dụng do ưu điểm dễ thực hiện và chi phí thấp. _ Những ứng dụng của kỹ thuật RAPD: + Đánh giá đa dạng di truyền: Đã được áp dụng trên các đối tượng: cúc lai, cà phê, bắp, đậu nành, lúa mì, lúa mạch, dâu tây, khoai tây, cà chua, Cần quan tâm đến yếu tố nồng độ DNA, điều kiện thí nghiệm, chương trình chạy PCR và cần lựa chọn primer thích hợp cho sự đa hình cao. + Đối với nấm bệnh thực vật thì kỹ thuật RAPD đã được áp dụng để phân tích đa dạng di truyền của nhiều loại nấm khác nhau như: Leptosphaeria maculans (Desm.) Ces. et de Not, Corynespra cassiicola, Rhizoctonia solani, ... + Nhận diện chỉ thị phân tử: Ở Việt Nam, nghiên cứu đa dạng di truyền và mối tương quan giữa kiểu gene và kiểu hình phản ánh bệnh đạo ôn của một số giống lúa ở Việt Nam Những cải tiến của kỹ thuật RAPD: + Kỹ thuật thứ nhất: sử dụng cùng lúc 2 primer khác nhau thay vì sử dụng 1 primer như kỹ thuật RAPD thông thường. Phương pháp này có thể làm tăng hoặc giảm đi số băng so với khi sử dụng một primer. Việc lựa chọn, sử dụng cùng lúc 2 primer khác nhau một cách phù hợp cũng có thể làm tăng tính đa hình của những primer cho sản phẩm ít đa hình. + Kỹ thuật thứ hai: cắt DNA bằng các enzyme giới hạn trước hoặc sau khi thực hiện phản ứng PCR. Sự cắt này cũng có thể tạo ra hai kết quả. Một là có thể làm giảm số lượng các băng khó xác định (complex band), điều đó làm dễ dàng hơn cho việc đánh giá đa dạng di truyền. Hai là tạo ra sự đa hình ở các mẫu có hạn chế về sự đa hình. Tuy nhiên việc sử dụng những cải tiến tuỳ thuộc vào chiến lược nhằm làm tăng số chỉ thị đa hình có thể hoặc đạt được các chỉ thị đồng trội. Những cải tiến này có hạn chế là làm giảm đi lợi thế của kỹ thuật RAPD cụ thể là tốc độ, giá thành và sử dụng phức tạp hơn