Đề tài Thu nhận trứng bò, heo để cải thiện quy trình đông lạnh trứng trong điều kiện Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP.HCM KHOA SINH HỌC  BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NCKH CẤP TRƯỜNG THU NHẬN TRỨNG BÒ, HEO ĐỂ CẢI THIỆN QUY TRÌNH ĐÔNG LẠNH TRỨNG TRONG ĐIỀU KIỆN VIỆT NAM Mã số: CS.2008.19.28. CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: ThS. NGUYỄN THỊ THƯƠNG HUYỀN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 05/2009 PHẦN MỞ ĐẦU 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Sự phát triển của Công nghệ sinh sản nói chung và kỹ thuật đông lạnh nói riêng đã đem lại nhiều tiềm năng ứng dụng có ý nghĩa không chỉ về kinh tế mà còn có ý nghĩa về khoa học. Đặc biệt, kỹ thuật đông lạnh trứng ngoài việc ứng dụng trong điều trị vô sinh còn là nền tảng cho những nghiên cứu mới của nhân loại trong nhiều lĩnh vực: y sinh học nhằm thu nhận tế bào gốc phôi, nhân giống vật nuôi, bảo quản nguồn gen in vitro, chuyển gen, sinh sản vô tính Ở nước ta trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu được triển khai nhằm nhân nhanh đàn bò để thực hiện “Chiến lược phát triển chăn nuôi đến năm 2020” do Thủ tướng chính phủ đề ra (16/1/2008). Tuy nhiên, các nghiên cứu này còn gặp khó khăn do nguồn trứng không đủ để tiến hành các thí nghiệm nuôi chín trứng, thụ tinh trong ống nghiệm (in vitro fertilization_IVF)Nguyên nhân của vấn đề này là do hạn chế trong việc vận chuyển và chi phí. Do đó, cung cấp nguồn trứng có chất lượng cao với giá thành thấp đang được quan tâm. Heo là đối tượng động vật quan trọng cho việc nghiên cứu sinh lý và bệnh học ở người. Kỹ thuât chuyển gen đang đóng vai trò thiết yếu trong việc tạo ra heo có kiểu gen cho các hướng nghiên cứu khác: khai thác tế bào gốc phôi, cắt phôi Xa hơn nữa, công nghệ này còn có khả năng ứng dụng trong Y sinh: cấy ghép cơ quan, nội tạng Bảo quản lạnh giao tử và phôi từ heo có thể là một phuơng pháp thay thế hữu hiệu trong việc duy trì những cá thể sinh sản nhằm bảo tồn các kiểu gen quý hiếm. Đây là một cuộc cách mạng không chỉ với việc kiểm soát khả năng sinh sản ở heo mà còn với sự gia tăng sử dụng heo trong các ứng dụng về công nghệ Y sinh học. Hiện nay nguồn trứng chủ yếu được bảo quản bằng phương pháp đông lạnh, song tỷ lệ trứng sống sau khi rã đông theo tổng kết của các chuyên gia thế giới chưa cao (bò 30%, người 10%,). Chính điều này là làm tốn kém và hạn chế trong công việc của nhiều nước. Một trong những tác nhân giới hạn thành công của kỹ thuật đông lạnh trứng là xảy ra tổn thương lạnh trong suốt quá trình đông lạnh. Trứng rất dễ tổn thương khi tiếp xúc với nhiệt độ thấp của quá trình đông lạnh và để tránh điều này bằng cách sử dụng phương pháp thủy tinh hóa (Ruffing và cs., 1993; Martino và cs., 1996). Trên cơ sở đó, chúng tôi mạnh dạn thực hiện đề tài “Thu nhận trứng bò, heo để cải thiện cải thiện quy trình đông lạnh trứng trong điều kiện Việt Nam”. 2. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI - Thu nhận và nuôi trứng bò, heo đến giai đoạn trưởng thành (In vitro Maturaration_IVM) - Thử nghiệm khả năng sống của trứng bò, heo trưởng thành sau khi đông lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa. 3. CÁCH TIẾP CẬN ĐỀ TÀI  Tiếp cận với nhu cầu đòi hỏi của xã hội và tầm quan trọng của vấn đề này trong cuộc sống; đồng thời các điều kiện về kiến thức, điều kiện phòng thí nghiệm cho phép ứnng dụng Công nghệ Sinh học.  Tiếp cận với các chuyên gia đầu ngành để học tập, trao đổi kỹ thuật, kinh nghiệm: Tham gia lớp học về các kỹ thuật thu nhận, nuôi, đông lạnh trứng, thụ tinh trong ống nghiệm trên đối tượng bò heo tại Viện Chăn nuôi quốc gia, Hà Nội (tháng 05/2008) do TS. Otoi (Người Nhật) và các cán bộ của viện đảm trách  Tra cứu các tài liệu liên quan trong và ngoài nước  Tiếp cận với các kỹ thuật hiện đại: hệ thống máy đông lạnh và giải đông trứng, kỹ thuật vi thao tác, PCR 4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU  Phương pháp trực quan (nghiên cứu trực tiếp): thu nhận trứng và xử lý trứng, đông lạnh trứng, giải đông trứng, kiểm tra, đánh giá tỷ lệ trứng sống sau khi rã đông.  Phương pháp tổng hợp  Phương pháp so sánh 5. PHẠM VI NGHIÊN CỨU  Trứng bò từ các nguồn khác nhau: từ viện chăn nuôi quốc gia, lò mổ Vissan  Trứng heo từ lò mổ Vissan Tp. HCM 6. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU  NỘI DUNG 1: Đông lạnh trứng heo trưởng thành bằng phương pháp thủy tinh hóa trong vi giọt (PP1) và trong cọng rạ (PP2)  NỘI DUNG 2: Đông lạnh trứng bò trưởng thành bằng phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ (PP2)  NỘI DUNG 3: Đông lạnh trứng bò chưa trưởng thành bằng phương pháp thủy tinh hóa trong vi giọt (PP1) và trong cọng rạ (PP2) 7. SẢN PHẨM CỦA ĐỀ TÀI Kết quả khoa học Đã tiến hành thu nhận và bảo quản nguồn trứng bò, heo thu nhận từ lò mổ bằng phương pháp thủy tinh hóa trong vi giọt và trong cọng rạ. Kết quả sản phẩm Đã bảo quản được số lượng trứng vượt với chỉ tiêu đề ra trong thuyết minh:  71 cọng rạ chứa 386 trứng heo đã IVM  36 cọng rạ chứa 197 trứng bò đã IVM  70 cọng rạ chứa 365 trứng bò chưa trưởng thành  305 trứng heo đã IVM trong vi giọt  477 trứng bò chưa trưởng thành trong vi giọt Kết quả đào tạo 02 cử nhân  Phan Bá Quy: Thử nghiệm bảo quản trứng bò trưởng thành bằng phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ (vitrification)- 2008  Nguyễn Quốc: Bảo quản trứng bò bằng phương pháp thủy tinh hóa (vitrification) – 2009. (Chuẩn bị báo cáo tốt nghiệp vào ngày 25/05/2009) 01 SV nghiên cứu khoa học đạt giải nhì cấp trường Đỗ Hoàng Hùng: Thử nghiệm bảo quản trứng bò, heo bằng phương pháp thủy tinh hóa trong vi giọt (microdrop vitrification) – 2009. Kết quả bài báo, báo cáo đã công bố  01 bài đăng trong Hội nghị Khoa học, Đại học Khoa học Tự nhiên Tp. HCM, 2008 (Bảo quản trứng bò bằng phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ)  01 bài đăng trong Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ, 2008 (Bảo quản trứng bò bằng phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ; đang chờ phản biện) CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ ĐÔNG LẠNH TRỨNG 1.1.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước Khái niệm thủy tinh hóa hay toàn bộ vật chất có trạng thái trong suốt giống thủy tinh được mô tả đầu tiên vào năm 1890, sau đó được Luyet mô tả lại vào năm 1937 (Luyet, 1937) [46]. Vào nửa cuối thập kỷ 1940, Chang đã thực hiện những nghiên cứu đầu tiên về bảo quản phôi thỏ ở nhiệt độ thấp [3]. Đến năm 1949, Polge và cs. phát hiện ra glycerol có thể giữ được sức sống của tinh trùng gia cầm khi nhiệt độ được hạ xuống -70oC [65]. Phát hiện này mở ra khả năng có thể bảo quản các loại tế bào và mô ở nhiệt độ thấp hơn. Smith (1952) đã đông lạnh phôi thỏ ở nhiệt độ -79oC và -196oC nhưng đạt kết quả không cao. Sau khi rã đông, chỉ có 1% số phôi được bảo quản còn giữ được một phôi bào có khả năng tiếp tục phân chia [76]. Năm 1976, Parkening và cs. tiến hành đông lạnh trứng chuột ở -30oC và -50oC có tỉ lệ sống đạt 51 – 56%; ở -75oC chỉ đạt 18% trứng sống [60]. Một loạt nghiên cứu của tác giả Willadsen (1977) [85], Trouson (1977) [77], Massip (1979) [52], đã cải tiến phương pháp đông lạnh và rã đông theo phương pháp giảm từng bước một, nhằm pha loãng các chất bảo quản lạnh, tăng nhanh tốc độ đông lạnh và rã đông mà vẫn bảo tồn sức sống của phôi, thu được kết quả tốt ở bò và chuột. Những cải tiến này cũng hạn chế được sự biến đổi về hình thái học của phôi. Ngày nay, việc đơn giản hóa kĩ thuật đông lạnh và rã đông theo phương pháp một bước (one – step method) do Leibo (1980) đề xuất đã thực sự thúc đẩy việc sử dụng phôi cũng như tinh trùng đông lạnh rộng rãi trong sản xuất. Hiệu quả cho thấy khi sử dụng tinh đông lạnh thì sức sống của phôi đạt trên 80% và tỉ lệ thụ thai đạt 50 – 60% [40]. Đến năm 1985, Rall và Fahy đã công bố phương pháp đông lạnh cực nhanh còn gọi là phương pháp thủy tinh hóa, bằng cách nhúng trực tiếp phôi chuột 8 tế bào vào nitơ lỏng từ nhiệt độ trên 0oC, do đó chỉ mất vài giây để đông lạnh. Và ông đã thực hiện thành công trong trữ lạnh phôi gia súc (bò) [66]. Phương pháp này không yêu cầu những dụng cụ làm lạnh đắt tiền hay kĩ năng đặc biệt mà có thể tiến hành rất nhanh. Mặt khác, phương pháp thủy tinh hóa đơn giản hơn phương pháp đông lạnh thông thường. Từ đó, phương pháp thủy tinh hóa được sử dụng rộng rãi và bây giờ được xem như là phương pháp thay thế phương pháp đông lạnh chậm. Mặc dù, phương pháp đông lạnh bằng kỹ thuật thủy tinh hóa được Rall và Fahy thực hiện thành công đầu tiên trên phôi bò vào năm 1985 [66]. Tuy nhiên, quy trình này chỉ được Kuleshova và Lopata ứng dụng đầu tiên trên trứng người vào năm 1999 [37] và sau đó vài tháng, quy trình này cũng được thực hiện đầu tiên trên phôi người đang phát triển ở giai đoạn phôi nang bởi Lane [38]. Vào ngày 20/6/1999, em bé đầu tiên trên thế giới từ phôi trữ lạnh bằng kỹ thuật thủy tinh hóa ra đời [90]. Kỹ thuật đông lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa áp dụng thành công trên trứng bò (Martino và cs.,1996) [51]. Trên chuột, tỷ lệ hình thái trứng sống sau quy trình đông lạnh và rã đông bằng phương pháp thủy tinh hóa là 88% (Nakagata, 1989) [55]; 80% (Shaw, 1991) [72]; 99% (Lane, 2001) [39]; 90% (Kim, 2007) [36]. Trên bò, tỷ lệ trứng sống sau đông lạnh và rã đông là 85% (Otoi,1998) [58]; 87% (Asada, 2002) [12]; 88% (Men, 2002) [53]; đặc biệt Chian (2004) thu được tỷ lệ trứng bò sống sau rã đông đạt 92% khi dùng chất bảo quản đông lạnh là 15% ethylene glycol (EG) kết hợp với 15% dimethyl sulphoside (DMSO), và đạt 98% khi dùng 15% ethylene glycol (EG) kết hợp với 15% propylene glycol (PG)...[17]. Vào năm 2005, Fujihira thực hiện quy trình đông lạnh và rã đông trứng heo bằng phương pháp thủy tinh hóa sử dụng Cryotop, với nồng độ EG trong dung dịch thủy tinh hóa là 30%, thu được tỷ lệ sống sau rã đông là 54 – 56% [24]. Trong năm này Martins R.D. và cs. đã đông lạnh trứng bò chưa chín bằng phương pháp thủy tinh hóa, sử dụng chất bảo quản là EG và sucrose, tỷ lệ trứng sống là 20% so với nhóm đối chứng là 74,6% [50]. Năm 2006, Cetin Yunus và Bastan Ayhan đã bảo quản trứng bò chưa trưởng thành bằng phương pháp thủy tinh hóa với các chất bảo quản khác nhau, tỷ lệ sống trên 20% so với nhóm đối chứng là 79,6% [18]. Somfai và cộng sự (2006) khảo sát ảnh hưởng của Cytochalasin B trên quá trình thủy tinh hóa trứng heo sử dụng phương pháp thủy tinh hóa trên bề mặt kim loại. Họ sử dụng quy trình bổ sung CPA qua 2 bước (trong EG 4% khoảng 10 – 15 phút ở 37oC, sau đó trong dung dịch thủy tinh hóa cuối cùng EG 35% với 5% PVP và trehalose 0.3M) [75]. Gupta và cộng sự (2007) sử dụng quy trình thủy tinh hóa tương tự với quy trình trên. Trong thử nghiệm sử dụng trứng giai đoạn túi mầm, kết quả được cải thiện khi kết hợp sử dụng EG và DMSO, vì vậy họ sử dụng kết hợp 2 chất này trên đối tượng trứng MII. Tuy nhiên phương pháp này làm giảm đáng kể khả năng phát triển của trứng (chỉ 3.4% phát triển đến blastocyst so với lô đối chứng là 20.1%) [28]. Morató và cs. (2008) đã bào quản trứng bò trưởng thành bằng phương pháp thủy tinh hóa bằng cọng rạ và cryoloop cho tỷ lệ trứng sống sau giải đông tương ứng là 88,4% và 94,5% [54]. 1.1.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam Ở Việt Nam, nghiên cứu đông lạnh phôi bò đã được tiến hành vào năm 1984. Phương pháp đông lạnh nhanh (tốc độ hạ nhiệt 12oC/phút) sau khi khử nước cục bộ ở nhiệt độ phòng trên phôi bò đã thành công với 63,4% (33/52) phôi phát triển trong ống nghiệm sau 48 giờ và 44,2% (23/52) phôi nang thoát màng và tỷ lệ có thai sau khi cấy phôi đông lạnh – rã đông là 33,3% (7/21) [3]. Năm 1990, con bê Charolais đầu tiên được sinh ra từ phôi đông lạnh nhập khẩu [2]. Năm 2003, Lưu Công Khánh và cs. đã báo cáo thành công việc nghiên cứu ứng dụng phôi bò đông lạnh bằng glycerol [5]. - Ngày 24/05/2004, trường hợp em bé đầu tiên của Việt Nam ra đời từ trứng trữ lạnh tại bệnh viện Từ Dũ [90]. - 2008, Nguyễn Thị Thương Huyền và cs. đã bảo quản thành công trứng bò bằng phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ với tỷ lệ trứng sống so với tổng số trứng đem đông lạnh sau giải đông 58,83% [4]. - Hiện nay các nhà khoa học đang nghiên cứu về việc bảo quản trứng ở động vật hữu nhũ, nhằm mục đích tạo ngân hàng bảo quản giao tử cái (trứng) để phục vụ cho các nghiên cứu sâu hơn: IVF, ICSI, cloning, chuyển gen, thu nhận tế bào gốc phôi 1.2. SINH LÝ BUỒNG TRỨNG 1.2.1. Quá trình hình thành và phát triển nang trứng Hình thành nang trứng là quá trình tiếp nối của các giai đoạn từ nang nguyên thủy phát triển thành nang sơ cấp và sau đó thành nang thứ cấp, các nang này sẽ phát triển, tích lũy dịch, phồng lên và di chuyển ra ngoài buồng trứng để chuẩn bị rụng trứng – đó là nang trứng chín (Hình 1.1). Và quá trình phát triển này ở gia súc từ giai đoạn nguyên thủy đến giai đoạn trước rụng trứng mất khoảng 180 ngày (Lussier và cs., 1987) [45]. Từ giai đoạn nguyên thủy đến giai đoạn tiền rụng trứng đường kính nang trứng bò tăng 30 đến 400 lần (từ 50m lên 15 đến 20mm). Trong quá trình này trứng hình thành màng trong suốt, tích lũy một số sản phẩm cần thiết cho sự thụ tinh và các giai đoạn đầu của sự phát triển phôi. Sau khi rụng nang trứng sẽ hình thành thể vàng. Số lượng nang trứng dự trữ trong buồng trứng ở các loài có sự khác nhau và thoái hóa dần trong quá trình phát triển của cá thể, càng lớn thì số nang trứng có hiệu quả càng ít. Ở bò, bê con lúc mới sinh ra có hơn 100.000 nang trứng và số lượng này giảm dần theo độ tuổi. Hình 1.1. Sự hình thành và phát triển nang trứng 1.2.2. Sự hình thành và phát triển của trứng Một trứng trưởng thành và sẵn sàng cho sự thụ tinh khi nó được phóng thích từ nang trứng trưởng thành của buồng trứng. Sự trưởng thành của trứng liên quan mật thiết với sự trưởng thành của các nang trứng (Hình 1.2). Quá trình phát triển của trứng gồm 4 giai đoạn: Sự di chuyển của các tế bào mầm vào cơ quan sinh dục; Sự gia tăng số lượng tế bào mầm bằng nguyên phân; Sự giảm vật liệu di truyền bằng giảm phân; Sự trưởng thành về cấu trúc và chức năng của trứng. Trong quá trình giảm phân của trứng có 2 giai đoạn trứng ở trạng thái ngừng tăng trưởng (block):  Giai đoạn trứng ở trạng thái ngừng tăng trưởng lần thứ nhất: khi trứng bước vào giai đoạn prophase của giảm phân I, cho ra trứng sơ cấp ở giai đoạn túi mầm (Germinal Vesicle_GV). Các trứng sẽ vượt qua giai đoạn này khi có sự xuất hiện của đỉnh LH (Luteinizing hormone) tức khi cá thể đến tuổi trưởng thành sinh dục.  Giai đoạn trứng ở trạng thái ngừng tăng trưởng lần thứ hai: khi ở giai đoạn metaphase-M của giảm phân II (MII), cho ra trứng thứ cấp ở giai đoạn MII. Trứng chỉ vượt qua được giai đoạn MII khi có sự thụ tinh của tinh trùng. Hình 1.2. Cấu trúc của buồng trứng và nang trứng Sự trưởng thành của trứng bao gồm những biến đổi ở mức tế bào để hỗ trợ cho sự thụ tinh và thời kỳ đầu của sự phát triển phôi thai (Sirard và cs., 1989) [73]. Sự trưởng thành trứng bao gồm:  Sự trưởng thành về nhân Quá trình trưởng thành trong nhân trải qua các giai đoạn: giai đoạn phá vỡ túi mầm (Germinal Vesicle Breakdown_GVBD), cô đặc nhiễm sắc thể, hình thành thoi vô sắc, phân chia nhiễm sắc thể tương ứng với việc tách ra của thể cực thứ I và dừng ở metaphase II. Ở bò, các nang trưởng thành đạt kích thước từ 2 - 3mm, một số trứng có khả năng xảy ra hiện tượng GVBD và hoàn tất quá trình giảm phân sau đó (Lonergan và cs., 1994 [42]; Fulka và Motlik., 1986 [25]). Và khi trứng đạt đến giai đoạn metaphase II sẽ đạt đường kính là 110m. Điều này giống với trứng thu từ nang nguyên thủy hoặc sơ cấp (chưa đạt đến kích thước khảo sát là tối ưu) không thể tiếp tục hay hoàn tất quá trình giảm phân và sẽ không có khả năng trưởng thành nhân. Do đó, đây là cơ sở cho việc chọn nang để thu trứng cho việc nuôi trưởng thành in vitro nhẳm đạt kết quả cao nhất.  Sự trưởng thành về tế bào chất Sự trưởng thành của tế bào chất bao gồm sự thay đổi toàn diện cấu trúc để trứng tiến từ giai đoạn túi mầm đến giai đoạn metaphase II (Shamsuddin và cs., 1993) [70]. Trong quá trình này, các bào quan được tổ chức lại chuẩn bị cho quá trình thụ tinh và tổng hợp protein chuẩn bị cho sự phát triển của phôi. Các ti thể thay đổi theo sự lớn lên của trứng. Khi trứng có kích thước nhỏ hơn 100mm, ti thể có dạng cầu và định vị tại trung tâm trứng. Nhưng khi trứng có đường kính 100mm, ti thể có hình trứng và di chuyển ra xa vị trí trung tâm, chúng có dạng hình túi và nằm tại vùng ngoại vi của trứng khi tế bào đạt đến kích thước 110mm. Các ti thể di chuyển dọc theo các vi ống được hình thành trong tế bào chất. Tương tự, các túi mầm sẽ di chuyển ra phía màng trong suốt khi trứng phát triển với kích thước hơn 110mm. Bộ Golgi chịu trách nhiệm hình thành các thể hạt vỏ của màng trong suốt. Và số lượng Golgi trong trứng tăng theo đường kính của nang. Có thể dễ dàng quan sát sự thay đổi vị trí của hạt vỏ trong suốt quá trình trưởng thành của tế bào chất. Cùng với sự thay đổi vị trí, sự thay đổi cấu trúc hạt vỏ là hai yếu tố có ý nghĩa đặc biệt đối với sự thụ tinh của trứng. Các thể hạt vỏ di chuyển ra phía màng trong suốt, giải phóng các chất bên trong làm cho màng trong suốt thay đổi cấu trúc, tăng kích thước nội bộ và hạn chế sự thụ tinh đa tinh trùng (polyspermy). Do vậy, sự trưởng thành về tế bào chất là yếu tố đánh giá gián tiếp khả năng của trứng khi thụ tinh, phân chia tế bào và phát triển đến giai đoạn phôi nang. 1.2.3. Cấu tạo của trứng Xung quanh trứng là lớp tế bào cumulus (granulose cell) kết hợp một cách chuyên biệt với trứng, giữa chúng có khe nối giúp duy trì quá trình trao đổi chất của trứng. Các lớp tế bào cumulus này vừa bảo vệ trứng, vừa cung cấp chất dinh dưỡng nuôi trứng. Đặc biệt là khi trứng rụng, trứng không còn nguồn cung cấp chất dinh dưỡng nào khác ngoài tế bào hạt. Tiếp đến là màng phóng xạ tỏa tròn. Bên trong màng phóng xạ là màng trong suốt của trứng, đóng vai trò rất quan trọng trong thụ tinh. Giữa màng trong suốt và màng tế bào chính là khoảng không quanh noãn. Trong màng tế bào chất là bào tương và nhân chứa bộ nhiễm sắc thể đơn bội của loài. Trứng chín là trứng đang ở giai đoạn metaphase II với thể cực thứ nhất. (Hình 1.3) Hình 1.3. Tế bào trứng 1.3. CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐÔNG LẠNH TRỨNG 1.3.1. Các phương pháp đông lạnh Đông lạnh trứng là sự bảo quản thành công chức năng bình thường của trứng khi giảm nhiệt độ dưới mức phản ứng hóa học bình thường xảy ra (từ 37oC, 5%CO2 (điều kiện sinh lý) xuống - 196oC (nhiệt độ không sinh lý)). Đông lạnh trứng có thể phân loại theo hai cách chung là đông lạnh cân bằng “equilibrium” với phương pháp đông lạnh chậm (slow freezing) hay đông lạnh không cân bằng “nonequilibrium” với phương pháp đông lạnh nhanh (rapid freezing) và phương pháp thủy tinh hóa (vitrification), tùy theo tốc độ làm lạnh và chất bảo quản đông lạnh sử dụng. Tuy nhiên, bản chất của các phương pháp này là giống nhau, cụ thể là đều có mục đích chung nhằm bảo vệ tế bào khỏi ảnh hưởng của tinh thể đá nội bào, sự khử nước và thay đổi mạnh mẽ nồng độ chất tan ở cả nhiệt độ cao và nhiệt độ thấp.  Phương pháp thủy tinh hóa (Vitrification) Thủy tinh hóa là quá trình làm lạnh mẫu trứng hoặc phôi với thời gian rất nhanh. Trong suốt quá trình hạ nhiệt độ, toàn bộ khối vật chất bên trong và bên ngoài tế bào chuyển thành dạng khối đặc, trong suốt giống như thủy tinh (glass-like), đặc biệt không có sự hình thành tinh thể đá bên trong mẫu tế bào, cũng như môi trường bên ngoài trong quá trình làm lạnh. [50, 54] Phương pháp này loại trừ hạn chế của quá trình đông lạnh chậm là cần thiết bị phức tạp. Một thuận lợi nữa của phương pháp này là khả năng sống của tế bào cao nếu điều kiện tối ưu do không có tinh thể đá ngoại bào. Gần đây hơn, những phương pháp thủy tinh hóa cải tiến đã được phát triển, có khả năng làm lạnh và làm ấm cực nhanh nhờ giảm thiểu thể tích của dung dịch bảo quản. Phương pháp này hy vọng có khả năng bảo quản tế bào dễ bị tổn thương do đông lạnh. Trong phương pháp thủy tinh hóa, tế bào cần được xử lí theo các bước đông lạnh thông thường như cân bằng trong dung dịch bảo vệ lạnh pha loãng, ngâm tron