Khóa luận Khảo sát khả năng sinh Bacteriocin của vi khuẩn Lactic phân lập trên nem chua

iBỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH BACTERIOCIN CỦA VI KHUẨN LACTIC PHÂN LẬP TRÊN NEM CHUA Họ và tên sinh viên: TRẦN THỊ THANH THẢO Ngành: BẢO QUẢN CHẾ BIẾN NÔNG SẢN VÀ VI SINH THỰC PHẨM Niên khóa: 2006 - 2010 Tháng 08/2010 ii KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH BACTERIOCIN CỦA VI KHUẨN LACTIC PHÂN LẬP TRÊN NEM CHUA Tác giả TRẦN THỊ THANH THẢO Khóa luận được đệ trình đề để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Kỹ sư ngành Bảo quản chế biến nông sản và vi sinh thực phẩm Giáo viên hướng dẫn: Tiến sĩ Hồ Thị Nguyệt Thu Tháng 08/2010 - 1 - LỜI CẢM TẠ Với tấm lòng tôn sư trọng đạo, em xin chân thành cảm ơn Qúy Thầy Cô Trường Đại học Nông Lâm, đặc biệt là các Thầy Cô Khoa Công nghệ Thực phẩm đã tận tình dạy bảo trong những năm vừa qua, truyền đạt những kiến thức quý báu để làm hành trang cho em bước vào đời. Xin chân thành cảm ơn Cô Hồ Thị Nguyệt Thu đã tận tình hướng dẫn, truyền thụ kinh nghiệm, cũng như tạo những điều kiện tốt nhất cho em trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Xin ghi nhớ công ơn của Cha Mẹ đã không quản mọi gian lao khó nhọc và sự hy sinh cao cả để cho con có được ngày hôm nay. Xin gửi đến những người thân yêu, các anh chị và các bạn lớp DH06VT lời cảm ơn sâu sắc. Sinh viên Trần Thị Thanh Thảo - 2 - TÓM TẮT Nem chua là một sản phẩm lên men truyền thống rất phổ biến của Việt Nam, được ưa thích bởi vị chua tự nhiên và cấu trúc giòn, dai đặc trưng. Tuy nhiên, bên cạnh đó, vấn đề chất lượng vệ sinh đang là mối quan tâm hàng đầu của người tiêu dùng lẫn người sản xuất. Với nguyện vọng cải thiện hơn nữa chất lượng của sản phẩm về mặt vệ sinh và định hướng phát triển nem chua thành thực phẩm chức năng, chúng tôi thực hiện đề tài “Khảo sát khả năng sinh bacteriocin của vi khuẩn lactic phân lập trên nem chua” nhằm tìm ra các chủng vi khuẩn lactic có khả năng tạo ra các hợp chất kháng lại vi khuẩn gây bệnh, ổn định chất lượng sản phẩm. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên các mẫu nem ở 5 cơ sở khác nhau. Trong đó, 3 cơ sở (Bà Chín, Ninh Hòa và Năm Thu) sử dụng lên men tự nhiên trong khi 2 cơ sở còn lại (Vissan và Giáo Thơ) thực hiện lên men có định hướng. pH bột thịt được đo lường vào ngày lên men thứ tư của nem chua. Vi khuẩn lactic trong bột thịt nem ngày này cũng được đếm tổng lượng, phân lập, khảo sát các đặc tính sinh hóa và tìm hiểu khả năng sinh bacteriocin của chúng. Kết quả đo lường cho thấy, pH bột thịt ngày thứ 4 ở ba cơ sở lên men tự nhiên khác nhau không có ý nghĩa (p > 0,05); trong đó, nem ở cơ sở Năm Thu có giá trị pH thấp nhất (4,34  0,03). Đối với hai cơ sở lên men có định hướng, phân tích thống kê cho thấy pH bột thịt ngày 4 của chúng khác nhau một cách có ý nghĩa (p ≤ 0,05); trong đó, Vissan có giá trị pH thấp hơn (4,15  0,03). Tổng lượng vi khuẩn lactic ngày 4 của các mẫu nem ở 3 cơ sở lên men tự nhiên khác nhau một cách có ý nghĩa (p ≤ 0,05). Nem ngày 4 của cơ sở Năm Thu (1,62.108 CFU/g) cao hơn hai cơ sở còn lại (lần lượt là 1,43.108 và 1,29.108 CFU/g). Đối với 2 cơ sở lên men có định hướng, Vissan và Giáo Thơ, tổng lượng vi khuẩn lactic (lần lượt là 1,15.109 và 3,08.108 CFU/g) cao hơn rất nhiều so với 3 cơ sở lên men tự nhiên. Giữa hai cơ sở lên men định hướng, sự khác biệt về tổng lượng vi khuẩn lactic nem ngày 4 là rất có ý nghĩa (p ≤ 0,001). Chúng tôi ghi nhận được 7 dạng vi khuẩn lactic tại 5 cơ sở khảo sát; trong đó, đa phần có dạng que (chiếm 81,82% các chủng vi khuẩn kiểm tra). - 3 - Khảo sát khả năng kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn lactic, chúng tôi nhận thấy có 01 chủng vi khuẩn thuộc dạng VII ở nem Ninh Hòa có khả năng kháng lại Staphylococcus aureus ssp. aureus CIP 20256 và 01 chủng dạng I của nem Ninh Hòa kháng lại Salmonella indiana LMBA. - 4 - MỤC LỤC Trang Trang tựa........................................................................................................................... i Lời cảm tạ ........................................................................................................................ ii Tóm tắt............................................................................................................................ iii Mục lục ............................................................................................................................ v Danh sách chữ viết tắt ..................................................................................................viii Danh sác các hình ...........................................................................................................ix Danh sách các bảng ........................................................................................................ ix CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU .................................................................................................1 CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN .........................................................................................3 2.1 Thực phẩm lên men và triển vọng phát triển.............................................................3 2.2 Nem chua – Sản phẩm thịt lên men của Việt Nam ...................................................4 2.3 Quá trình lên men lactic.............................................................................................5 2.4 Khái quát về vi khuẩn lactic ......................................................................................5 2.5 Một số vi khuẩn lactic thường dùng trong thực phẩm ..............................................6 2.5.1 Lactobacillus ....................................................................................................6 2.5.2 Lactococcus ......................................................................................................7 2.5.3 Leuconostoc ......................................................................................................7 2.5.4 Streptococcus....................................................................................................7 2.5.5 Pediococcus ......................................................................................................8 2.6 Bacteriocin.................................................................................................................8 2.6.1 Khái niệm chung...............................................................................................8 2.6.2 Phân loại ...........................................................................................................9 2.6.2.1 Lớp I ........................................................................................................9 2.6.2.2 Lớp II .....................................................................................................10 2.6.2.3 Lớp III....................................................................................................11 2.6.3 Cơ chế hoạt động ............................................................................................11 2.6.4 Lợi ích và hạn chế của bacteriocin .................................................................12 - 5 - 2.6.4.1 Lợi ích của bacteriocin ..........................................................................12 2.6.4.2 Hạn chế của bacteriocin.........................................................................13 CHƯƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................14 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ...........................................................................14 3.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu.......................................................................14 3.2.1 Môi trường và thiết bị phân tích .....................................................................14 3.2.2 Nguyên vật liệu thí nghiệm ............................................................................14 3.3 Nội dung nghiên cứu ...............................................................................................15 3.4 Phương pháp nghiên cứu .........................................................................................15 3.4.1 Khảo sát hệ vi khuẩn lactic trên nem ngày bốn của năm cơ sở khảo sát ...............................................................................................................17 3.4.1.1 Phương pháp lấy mẫu ............................................................................17 3.4.1.2 Đồng nhất mẫu ......................................................................................17 3.4.1.3 Kỹ thuật đo pH ......................................................................................17 3.4.1.4 Khảo sát hệ vi khuẩn lactic....................................................................17 3.4.1.5 Đếm khuẩn lạc và cấy chuyền ...............................................................18 3.4.2 Định danh sơ bộ vi khuẩn lactic phân lập ......................................................19 3.4.2.1 Nhuộm Gram .........................................................................................19 3.4.2.2 Phản ứng catalase ..................................................................................19 3.4.2.3 Khảo sát khả năng di động ...................................................................19 3.4.2.4 Kiểm tra kiểu lên men ...........................................................................19 3.4.2.5 Khảo sát khả năng sinh acid lactic ........................................................20 3.4.3 Khảo sát khả năng sinh bacteriocin của các chủng vi khuẩn lactic phân lập ..........................................................................................................20 3.4.3.1 Thu hoạch dịch ly tâm ...........................................................................20 3.4.3.2 Khảo sát sơ bộ khả năng sinh bateriocin của các chủng vi khuẩn phân lập....................................................................................20 3.4.3.3 Khảo sát khả năng sinh bacteriocin của các chủng lactic phân lập bằng phương pháp khuếch tán trên thạch .................................21 3.5 Xử lý thống kê số liệu thu thập ...............................................................................22 - 6 - CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..............................................................23 4.1 Khảo sát hệ vi khuẩn lactic của nem chua sau 4 ngày lên men ở năm cơ sở khảo sát .....................................................................................................23 4.1.1 Giá trị pH và tổng lượng vi khuẩn lactic của nem chua lên men ngày 4 ở 5 cơ sở khảo sát ........................................................................................23 4.1.2 Phần trăm các dạng khuẩn lạc của nem chua lên men ngày 4 ở 5 sơ sở khảo sát.........................................................................................25 4.2 Tính chất sinh hóa của những dạng khuẩn lạc phân lập ..........................................31 4.3 Khảo sát khả năng sinh bacteriocin của các chủng vi khuẩn lactic phân lập..........................................................................................................................33 CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................36 5.1 Kết luận....................................................................................................................36 5.2 Đề nghị ....................................................................................................................37 TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................................38 PHỤ LỤC .....................................................................................................................41 - 7 - DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT CFU: Colony Forming Unit LAB: Lactic Acid Bacteria EMP: Embden - Meyerhof - Parnas pathway MRS NB MRD TSA - 8 - DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình 2.1: Cấu trúc của nisin .........................................................................................10 Hình 3.1: Tiến trình thực hiện các khảo sát..................................................................16 Hình 3.2: Trình tự pha loãng cho việc đếm vi khuẩn lactic .........................................18 Hình 3.3: Vùng kháng khuẩn của dịch bacteriocin trên đĩa petri .................................22 Hình 4.1: Dạng và hình thái tế bào của khuẩn lạc dạng I .............................................26 Hình 4.2: Dạng và hình thái tế bào của khuẩn lạc dạng II ...........................................26 Hình 4.3: Dạng và hình thái tế bào của khuẩn lạc dạng III ..........................................27 Hình 4.4: Dạng và hình thái tế bào của khuẩn lạc dạng IV ..........................................27 Hình 4.5: Dạng và hình thái tế bào của khuẩn lạc dạng V ...........................................28 Hình 4.6: Dạng và hình thái tế bào của khuẩn lạc dạng VI ..........................................28 Hình 4.7: Dạng và hình thái tế bào của khuẩn lạc dạng VII ........................................28 Hình 4.8: Sự chuyển màu của dung dịch trong khảo sát khả năng sinh acid lactic của vi khuẩn..........................................................................................33 Hình 4.9: Vùng kháng khuẩn của chủng vi khuẩn dạng VII đối với Staphylococcus aureus ssp. aureus CIP ........................................................................34 Hình 4.10: Vùng kháng khuẩn của chủng vi khuẩn dạng I đối với Salmonella indiana LMBA ...........................................................................................35 DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 4.1: Giá trị pH và tổng lượng vi khuẩn lactic của nem chua ngày 4 ở năm cơ sở khảo sát.........................................................................................................23 Bảng 4.2: Phần trăm các dạng khuẩn lạc của nem chua ngày 4 ở năm sơ sở khảo sát .........................................................................................................29 Bảng 4.3 Tính chất sinh hóa của những dạng khuẩn lạc phân lập .......................................................................................................................................32 - 9 - Chương 1 MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ Nem chua là một trong những sản phẩm lên men truyền thống nổi tiếng của Việt Nam được làm từ thịt heo, bì và một số phụ liệu khác. Ngày nay, nem chua được sản xuất tại nhiều vùng của đất nước với những thương hiệu nổi tiếng như: nem Bình Dương, nem Thủ Đức, nem Lai Vung… Phần lớn nem chua được sản xuất ở qui mô hộ gia đình theo phương thức lên men tự nhiên nên chất lượng sản phẩm thường không ổn định. Mặt khác, nem chua là sản phẩm thường được tiêu thụ sống sau 3 - 4 ngày lên men mà không qua chế biến. Do đó, vấn đề về vệ sinh hiện là mối quan tâm cấp bách của người tiêu dùng lẫn nhà sản xuất. Ngày nay, việc sử dụng những chất kháng khuẩn hóa học trong thực phẩm bị người tiêu dùng từ chối vì những lí do sức khỏe. Do đó, liệu có thể tìm ra các chủng vi sinh vật khởi động vừa có khả năng định hướng quá trình lên men, đảm bảo tính ổn định và cải thiện chất lượng sản phẩm vừa có khả năng sinh ra những chất có khả năng kháng lại các vi khuẩn gây bệnh? Trước những yêu cầu trên, vi khuẩn lactic (LAB) là nhóm vi khuẩn được chú ý nhiều nhất. Những vi khuẩn này được sử dụng lâu đời với mục đích acid hóa nguyên liệu thông qua việc sản sinh các acid hữu cơ, đặc biệt là acid lactic; mặt khác, chúng còn có khả năng sinh ra các hợp chất có khả năng kháng khuẩn quan trọng trong việc bảo quản thực phẩm như: hydrogen peroxide, carbon dioxide, diacetyl, bacteriocin, reuterin và reutericyclin (Ouwehand và Vesterlund, 2004). Trong đó, bacteriocin là hợp chất kháng khuẩn được quan tâm nhiều nhất. Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh một vài giống vi khuẩn lactic có khả năng sản sinh bacteriocin kháng lại các vi sinh vật gây hư hỏng trong thực phẩm như: Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella… Đề tài “Khảo sát khả năng sinh bacteriocin của vi khuẩn lactic phân lập trên nem chua” được thực hiện nhằm tìm ra các chủng vi khuẩn lactic có khả năng đề - 3 - kháng với các vi sinh vật gây bệnh, tạo tiền đề cho chế biến nem chua có chất lượng ổn định cũng như an toàn về mặt vi sinh. 1.2 MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU Đề tài này được thực hiện nhằm mục đích khảo sát khả năng tạo bacteriocin của một số vi khuẩn lactic hiện diện trong nem chua. Qua đó hi vọng sẽ cải thiện nem chua thành một thực phẩm chức năng có lợi cho sức khỏe. Yêu cầu thực hiện:  Phân lập vi khuẩn lactic trên 5 loại nem lên men ngày 4.  Thực hiện các phản ứng sinh hóa tiền định danh vi khuẩn lactic.  Khảo sát khả năng kháng khuẩn của các vi khuẩn lactic phân lập được. - 4 - Chương 2 TỔNG QUAN 2.1 THỰC PHẨM LÊN MEN VÀ TRIỂN VỌNG PHÁT TRIỂN Lên men là một trong những công nghệ lâu đời nhất được sử dụng để bảo quản thực phẩm. Trong lịch sử, việc lên men thực phẩm đã được khởi xướng cách đây ít nhất 6000 năm (Holzapfef, 2000). Bắt nguồn từ các nước đang phát triển, quá trình lên men không chỉ nhằm mục đích bảo quản mà còn góp phần đa dạng hóa thực phẩm với chi phí phải chăng đáp ứng cho người tiêu dùng có thu nhập thấp (Kalui và ctv, 2010). Hiện nay, nhiều loại thực phẩm lên men được sản xuất trên toàn thế giới ở qui mô hộ gia đình cũng như ở qui mô công nghiệp. Sự phổ biến rộng rãi của thực phẩm lên men cho thấy tầm quan trọng cũng như sự ưa chuộng ngày càng tăng của các sản phẩm này trên thế giới. Trong một số vùng, đặc biệt ở châu Phi, những thực phẩm này còn được sử dụng làm thực phẩm cai sữa cho trẻ nhỏ (Lei và Jakobsen, 2004; trích dẫn bởi Kalui và ctv, 2010). Các nghiên cứu được thực hiện đã cho thấy những thuộc tính vô giá của sản phẩm lên men. Quá trình lên men tạo ra các hợp chất chuyển hóa góp phần cải thiện mùi vị và chất lượng dinh dưỡng của sản phẩm. Bên cạnh đó, một số sản phẩm của quá trình sinh tổng hợp như acid lactic, ethanol, acetaldehyd, acid pyruvic,… làm thay đổi pH và giúp ức chế hiệu quả các vi sinh vật gây bệnh. Điều này tăng cường tính an toàn và kéo dài tuổi thọ cho sản phẩm một cách đáng kể (Motarjemi, 2002). Thêm vào đó, các enzyme ngoại sinh trong nguyên liệu lên men cũng góp phần cải thiện những đặc tính trên (Holzapfel, 2000). Việc sử dụng giống khởi động vào việc sản xuất các sản phẩm lên men ngày càng được áp dụng rộng rãi như một phương pháp để rút ngắn thời gian sản xuất, nâng cấp sản phẩm lên men về mặt chất lượng, tính ổn định cũng như tuổi thọ cho sản phẩm (Rolle và Satin, 2002). Một số vi sinh vật có lợi trong quá trình lên men được nghiên cứu như vi khuẩn lactic cho thấy rằng chúng có khả năng sản sinh ra các chất kháng - 14 - sinh có lợi cho sức khỏe, tạo tính an toàn và bảo quản lâu dài cho sản phẩm (Kalui và ctv, 2010). Thực phẩm lên men ngày nay rất đa dạng, chế biến từ các dạng nguyên liệu khác nhau như thịt, trái cây, rau quả, ngũ cốc,… Với những tiến bộ hiện nay về khoa học kĩ thuật, quá trình lên men không còn sản xuất ở qui mô thủ công và tiến hành tự nhiên như trước đây nữa mà đã phát triển ở qui mô công nghiệp với sự lên men chủ động nhờ việc sử dụng các giống khởi động để đáp ứng không chỉ về chất lượng mà còn về số lượng cho người tiêu dùng (Nguyễn Đức Lượng, 2006). 2.2 NEM CHUA - SẢN PHẨM THỊT LÊN MEN CỦA VIỆT NAM Nem chua là một sản phẩm thịt lên men truyền thống ở Việt Nam. Tùy theo từng vùng miền sản xuất mà nem chua gắn với những tên gọi nổi tiếng như nem Thủ Đức, nem Lai Vung, nem Bình Dương… Phần lớn sản phẩm được sản xuất thủ công, tùy theo kinh nghiệm của từng hộ gia đình mà chất lượng và khả năng bảo quản nem chua rất khác nhau. Bản chất của quá trình lên men là một quá trình chuyển hóa đường thành acid lactic nhờ hoạt động của vi khuẩn Lactob