Khóa luận Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch đối với Protein tái tổ hợp MBP-VT2eB trên thỏ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ****0O0**** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH ĐỐI VỚI PROTEIN TÁI TỔ HỢP MBP-VT2eB TRÊN THỎ Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa : 2001 – 2005 Sinh viên thực hiện : PHAN LÊ MAI Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8-2005 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ****0O0**** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH ĐỐI VỚI PROTEIN TÁI TỔ HỢP MBP-VT2eB TRÊN THỎ Giáo Viên Hướng Dẫn: Sinh Viên Thực Hiện: TSKH NGUYỂN NGỌC HẢI PHAN LÊ MAI PGS.TSKH NGUYỄN LÊ TRANG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8-2005 iii LỜI CẢM ƠN Con luôn nhớ ơn ba mẹ sinh thành, dưỡng dục và tạo mọi điều kiện cho con tự hoàn thiện mình, cảm ơn sự quan tâm, động vịên của mọi người trong gia đình. Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, Ban Chủ nhiệm bộ môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tại trường. Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS khoa học Nguyễn Ngọc Hải, người Thầy đã dạy bảo em rất nhiều và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khoá luận. Con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS-TS khoa học Nguyễn Lê Trang, người Thầy, người bác đã dạy bảo con rất nhiều và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp con hoàn thành khoá luận. Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Thạc sỹ Nguyễn Kim Dung, người Thầy đã dạy bảo em rất nhiều và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khoá luận. Em xin chân thành cảm ơn chị Nguyễn Thị Nguyệt Thu, chị Đỗ Thị Châm, chị Lạc Ngọc Thêm, chị Võ Thị Mỹ Duyên, chị Dương Ngọc Diễm, chị Doãn Thị Sim, Thầy Lưu Đức Lợi, anh Nguyễn Văn Thương đã tận tình giúp đỡ chỉ bảo em trong suốt thời gian thực tập khoá luận tốt nghiệp. Cảm ơn các bạn bè thân yêu của lớp DH01SH đã san sẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập. iv TÓM TẮT PHAN LÊ MAI, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2005. “NGHIÊN CỨU ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH ĐỐI VỚI PROTEIN TÁI TỔ HỢP MBP- VT2eB TRÊN THỎ”. Hội đồng hướng dẫn: TS khoa học Nguyễn Ngọc Hải PGS-TS khoa học Nguyễn Lê Trang Độc tố verotoxin VT2eB do E. coli tiết ra là tác nhân chính gây ra bệnh phù đầu và tiêu chảy trên heo con, gây thiệt hại rất lớn cho ngành chăn nuôi heo của nước ta. Do vậy các nghiên cứu nhằm tạo ra vaccin phòng bệnh phù đầu trên heo đang nhận được sự quan tâm rất lớn, mở ra nhiều triển vọng cho ngành chăn nuôi heo nước ta. Hiện nay, TS Nguyễn Ngọc Hải và các cộng sự đã thành công trong việc tạo ra được chủng E. coli mang gen mã hoá cho protein tái tổ hợp MBP-VT2eB và tinh sạch được protein này. Từ thực tế đó, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch đối với protein tái tổ hợp MBP-VT2eB trên thỏ” nhằm xác định khả năng ứng dụng protein này trong nghiên cứu bệnh phù đầu do E. coli gây ra trên heo . Chúng tôi sử dụng phản ứng kết tủa khuếch tán trên thạch (kỹ thuật Ouchterlony) để đánh giá sự xuất hiện của kháng thể và phản ứng trung hoà độc tố VT2e trên môi trường tế bào vero để đánh giá hiệu giá kháng thể trung hoà độc tố verotoxin. Những kết quả đạt được sau 7 tháng nghiên cứu: - Cả hai quy trình gây miễn dịch dài ngày và ngắn ngày đều tạo kháng thể kháng MBP-VT2eB có hiệu quả. - Protein MBP-VT2eB có khả năng kích ứng đáp ứng miễn dịch trên thỏ tạo kháng thể trung hoà độc tố VT2e trên môi trường tế bào vero. - Kháng thể kháng protein tái tổ hợp MBP-VT2eB có khả năng trung hoà độc tố VT2e (gây bệnh phù đầu trên heo). v MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. iii TÓM TẮT ....................................................................................................................iv MỤC LỤC .....................................................................................................................v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ..................................................................... viii DANH MỤC CÁC HÌNH ..........................................................................................xi DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................................ xii DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ...................................................................................... xiii DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ ..................................................................................xiv PHẦN 1: MỞ ĐẦU .......................................................................................................1 1.1. Mở đầu ..............................................................................................................1 1.2. Mục tiêu và yêu cầu .........................................................................................1 1.2.1. Mục tiêu.....................................................................................................1 1.2.2. Yêu cầu......................................................................................................2 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................3 2.1. Kháng nguyên...................................................................................................3 2.2. Kháng thể..........................................................................................................3 2.2.1. Chuỗi nhẹ (L) ............................................................................................4 2.2.2. Chuỗi nặng (H) ..........................................................................................4 2.3. Đáp ứng miễn dịch ...........................................................................................5 2.3.1. Đáp ứng miễn dịch khi tiếp xúc kháng nguyên lần đầu ............................6 2.3.2. Đáp ứng miễn dịch khi tiếp xúc lại kháng nguyên những lần tiếp theo....6 2.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch ..........................................7 2.4. Cơ chế miễn dịch dịch thể .............................................................................10 2.5. Protein tái tổ hợp MBP-VT2eB ....................................................................15 2.6. Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch (Double diffusion in two dimensions) (Kỹ thuật Ouchterlony)...................................................................15 2.6.1. Sự kết hợp giữa kháng nguyên – kháng thể ............................................15 2.6.2. Phản ứng kết tủa theo kỹ thuật khuếch tán kép trên thạch (Double diffusion in two dimensions) (Kỹ thuật Ouchterlony) ......................................17 vi 2.7. Phản ứng trung hoà độc tố VT2e trên môi trường tế bào vero .................18 2.7.1. Sơ lược về tế bào vero .............................................................................18 2.7.2. Độc tố VT2e ............................................................................................19 2.7.3. Nguyên tắc của phản ứng trung hoà độc tố trên môi trường tế bào vero ....................................................................20 PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH ...............................21 3.1. Thời gian và địa điểm ....................................................................................21 3.2. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................21 3.3. Vật liệu và hoá chất........................................................................................21 3.3.1. Thú thí nghiệm .......................................................................................21 3.3.2. Vật liệu và hoá chất ................................................................................21 3.3.3. Môi trường ..............................................................................................22 3.3.4. Thiết bị và dụng cụ ..................................................................................22 3.4. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................22 3.4.1. Bố trí thí nghiệm .....................................................................................22 3.4.2. Chuẩn bị dịch tiêm .................................................................................24 3.4.3. Thu nhận kháng huyết thanh ..................................................................24 3.4.4. Xử lý kháng huyết thanh ........................................................................24 3.4.4.1. Tách kháng thể với ammonium sulfate bão hoà 100%S ........ 24 3.4.4.2. Hòa tan kháng thể ...................................................................25 3.5. Đánh giá .........................................................................................................27 3.5.1. Định tính: phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch (kỹ thuật Ouchterlony) .....................................................................................................27 3.5.2. Định lượng: phản ứng trung hoà độc tố VT2e trên môi trường tế bào vero ........................................................................................................ 28 3.5.2.1. Xác định liều TCID50 (Tissue Culture Infectious Dose 50) .....28 3.5.2.2. Thử phản ứng trung hoà độc tố ................................................ 31 vii 3.6. Chỉ tiêu theo dõi ............................................................................................ 33 3.7. Đánh giá kết quả và xử lý số liệu .................................................................33 PHẦN 4 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................34 4.1. Xác định kháng thể đặc hiệu với protein tái tổ hợp MBP-VT2eB bằng kỹ thuật Ouchterlony.................................................................................................. 34 4.1.1. Xác định quy trình thực hiện phản ứng ..................................................34 4.1.2. Đánh giá kết quả gây miễn dịch theo các quy trình ngắn ngày và dài ngày ......................................................................................35 4.1.2.1. Quy trình ngắn ngày ......................................................................35 4.1.2.2. Quy trình dài ngày .........................................................................36 4.1.3. Nhận xét...................................................................................................38 4.2. Xác định liều TCID50 ....................................................................................41 4.3. Phản ứng trung hoà độc tố VT2e trên môi trường tế bào vero ................42 4.3.1. Kiểm tra độ an toàn của kháng huyết thanh đối với tế bào vero ..............42 4.3.1.1. Kháng huyết thanh có bổ sung NaN3 và tế bào vero .......................43 4.3.1.2. Kháng huyết thanh có bổ sung NaN3 và có bất hoạt .......................43 4.3.1.3. Thí nghiệm đánh giá tác động của NaN3 .............................................................. 44 4.3.1.4. Kháng huyết thanh không bổ sung NaN3 và có bất hoạt .................44 4.3.2. Phản ứng trung hoà độc tố VT2e trên môi trường tế bào vero ..................46 4.3.2.1. Quy trình dài ngày ...........................................................................47 4.3.2.2. Quy trình ngắn ngày ........................................................................50 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...................................................................53 PHẦN 6: TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................54 PHỤ LỤC ................................................................................................................56 viii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ag ATCC DAG DMEM TCID50 EDTA FBS Gb4 Ig IL2 IL4 IL5 IL6 IP3 LB MAF MBP MHC class II antigens MIF MWCBs PCR Antigen American Type Culture Collection Diacylglycerol Dulbeccos Minimal Essential Medium Tissue culture infectious dose 50 Ethyllene diamine tetra acetic acid Fetal Bovine Serum Globotetraosyl ceramide Immunoglobulin Interleukin 2 Interleukin 4 Interleukin 5 Interleukin 6 Inositol triphosphate Lubria – Bertani Macrophage activating factor Maltose binding protein Major histocompatibility complex class II antigens Macrophage inhibitation factor Manufacturer's working cells bank Polymerase chain reaction Kháng nguyên Tổ chức sưu tầm nhân giống Mỹ Huyết thanh bào thai bê Globulin miễn dịch Yếu tố có tác dụng hoạt hoá đại thực bào Các kháng nguyên phù hợp tổ chức chính lớp II Ngân hàng tế bào đang làm việc ix PBS SLT TC TDTH TI TH Vero VT VT2e (SLT-IIv) VT2eB Phosphate buffer stalin Shiga-like toxin Cytotoxic T cell Delayed type hypersensitivity T cell Inducer T cell Helper T cell Vervet Monkey Origin Verotoxin SLT-II variant VT2e subunit B Tế bào lympho T gây độc Tế bào lympho T gây quá mẫn muộn Tế bào lympho T cảm ứng Tế bào lympho T giúp Độc tố Shiga-like toxin IIv Tiểu đơn vị B của VT2e x DANH MỤC CÁC HÌNH TRANG Hình 2.1: Hình 2.2: Hình 2.3: Hình 2.4: Hình 2.5: Hình 2.6: Hình 2.7: Hình 2.8: Hình 3.1: Hình 3.2: Hình 4.1: Hình 4.2: Hình 4.3: Hình 4.4: Hình 4.5: Hình 4.6: Cấu trúc kháng thể ................................................................................5 Đáp ứng miễn dịch của thú đối với 2 lần tiêm kháng nguyên được phản ảnh qua mức độ kháng thể trong kháng huyết thanh ...................7 Quá trình biệt hoá và phân chia của tế bào lympho B ........................11 Các quá trình diễn ra khi kháng nguyên kết hợp với các thụ thể trên bề mặt tế bào lympho B............................................................................12 Sự kết hợp giữa tế bào lympho TH và tế bào lympho B......................13 Tế bào lympho B xử lý và trình diện kháng nguyên cho tế bào lympho TH ........................................................................................................13 Tác động của các interleukin ở các giai đoạn khác nhau trong tiến trình đáp ứng miễn dịch của tế bào lympho B đối với kháng nguyên .........14 Hiện tượng hai kháng nguyên: đồng nhất (A), không đồng nhất (B), đồng nhất một phần (C) được phát hiện bằng phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch ................................................................................18 Bao thẩm tích ......................................................................................26 Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch (kỹ thuật Ouchterlony) ..27 Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 4 (mũi nhắc lại 1) ....................................................................................................34 Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 2 (mũi nhắc lại 1) ....................................................................................................35 Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 1 (mũi nhắc lại 2) ....................................................................................................36 Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 1 (đối chứng + kháng huyết thanh) ..........................................................................36 Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 2 (đối chứng + kháng huyết thanh) ..........................................................................36 Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 4 (mũi nhắc xi Hình 4.7: Hình 4.8: Hình 4.9: Hình 4.10: Hình 4.11: Hình 4.12: PHỤ LỤC Hình 1: Hình 2: Hình 3: Hình 4: Hình 5: Hình 6: lại 1) ....................................................................................................37 Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 5 (mũi nhắc lại 1) ....................................................................................................37 Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 3 (mũi nhắc lại 2) ....................................................................................................37 Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 3 (đối chứng + kháng huyết thanh) ..........................................................................37 Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 4 (đối chứng + kháng huyết thanh) ..........................................................................37 Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của mẫu thỏ 5 (đối chứng + kháng huyết thanh) ..........................................................................38 Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của hai quy trình gây miễn dịch ......................................................................................................40 Tế bào vero .........................................................................................60 Tế bào vero chịu tác động của độc tố VT2e .......................................60 Thú thí nghiệm ....................................................................................61 Tiêm protein MBP-VT2eB cho thỏ ....................................................61 Lấy máu tĩnh mạch tai thỏ ..................................................................62 Tủa kháng thể với ammonium sulfate 100%S ....................................62 xii DANH MỤC CÁC BẢNG TRANG Bảng 4.1: Bảng 4.2: Bảng 4.3: Bảng 4.4: Bảng 4.5: Bảng 4.6: Bảng 4.7: Kết quả phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch của hai quy trình gây miễn dịch ................................................................................................39 Kết quả đo OD620 mẫu nuôi cấy tế bào với dịch độc tố VT2e ................41 Kết quả đo OD620 của mẫu thỏ 4 (ngày thứ 7 sau mũi nhắc lại 3) .........45 Kết quả đo OD620 của mẫu thỏ 4 (mũi nhắc lại 3) và thỏ 5 (mũi nhắc lại 4) .............................................................................................................47 Kết quả đo OD620 của mẫu thỏ 3 (mũi nhắc lại 4) ..................................48 Kết quả đo OD620 của mẫu thỏ 2 ............................................................50 Kết quả phản ứng trung hoà độc tố của hai quy trình gây miễn dịch .....52 xiii DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ TRANG Sơ đồ 3.1: Sơ đồ 3.2: Sơ đồ 3.3: Sơ đồ 3.4: Quy trình tủa kháng thể với ammonium sulfate 100%S ........................25 Quy trình xác định liều TCID50 ..............................................................29 Quy trình nhuộm tế bào vero và đọc kết quả ở bước sóng 620 nm ........30 Quy trình trung hòa độc tố VT2e trên môi trường tế bào vero............... 32 xiv DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ Trang Biểu đồ 4.1: Biểu đồ 4.2: Biểu đồ 4.3: Biểu đồ 4.4: Biểu đồ 4.5: Đồ thị chuẩn độ độc tố VT2e ............................................................42 Đồ thị trung hòa độc tố VT2e của mẫu thỏ 4 (ngày thứ 7 sau mũi nhắc lại 3) trên môi trường tế bào vero .............................................46 Đồ thị trung hòa độc tố của mẫu thỏ 4 (mũi nhắc lại 3) và thỏ 5 (mũi nhắc lại 4) trên môi trường tế bào vero .............................................49 Đồ thị trung hòa độc tố của mẫu thỏ 3 (mũi nhắc lại 4) trên môi trường tế bào vero .............................................................................49 Đồ thị trung hòa độc tố của mẫu thỏ 2 trên môi trường tế bào vero .51 1