Luận án Nghiên cứu độc tính và tác dụng bảo vệ gan của sản phẩm Vismisco trên thực nghiệm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI BÙI THỊ QUỲNH NHUNG NGHIÊN CỨU ĐỘC TÍNH VÀ TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN CỦA SẢN PHẨM VISMISCO TRÊN THỰC NGHIỆM LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÀ NỘI - 2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI BÙI THỊ QUỲNH NHUNG NGHIÊN CỨU ĐỘC TÍNH VÀ TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN CỦA SẢN PHẨM VISMISCO TRÊN THỰC NGHIỆM Chuyên ngành : Dược lý và độc chất Mã số : 9720118 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Phạm Thị Vân Anh 2. PGS.TS. Nguyễn Trọng Thông HÀ NỘI - 2023 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án này, tôi đã nhận được sự hỗ trợ và giúp đỡ của rất nhiều Thầy Cô giáo, nhiều đồng nghiệp và cơ quan. Nhân dịp này, tôi xin bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc của mình: Lời đầu tiên cho tôi xin được cảm ơn Ban Giám hiệu, phòng Quản lý Đào tạo Sau đại học, bộ môn Dược lý đã trao cho tôi niềm vinh dự, tự hào khi được là học viên và nghiên cứu sinh của trường Đại học Y Hà Nội. Là nơi đã đào tạo và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài này. Xin trân trọng cảm ơn Tập thể cán bộ Bộ môn Dược lý, Đại học Y Hà Nội đã luôn hỗ trợ, tin tưởng, ủng hộ và nhiệt tình giúp đỡ tôi không chỉ trong thời gian thực hiện luận án mà còn trong công việc và cuộc sống hàng ngày. Tôi xin trân trọng cảm ơn Đảng ủy, Ban Giám hiệu, phòng Thanh tra khảo thí và Đảm bảo chất lượng giáo dục, Bộ môn Dược lâm sàng Trường Đại học Y Dược Thái Nguyên đã tạo điều kiện cho tôi được tham gia học tập nghiên cứu trong suốt thời gian qua. Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin trân trọng gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS. Phạm Thị Vân Anh, Trưởng Bộ môn Dược lý, Giám đốc Trung tâm Dược lý lâm sàng, Đại học Y Hà Nội, và PGS.TS. Nguyễn Trọng Thông, Nguyên Trưởng Bộ môn Dược lý, Nguyên Phụ trách Trung tâm Dược lý lâm sàng, Đại học Y Hà Nội - những người Thầy đã trực tiếp giảng dạy, tận tình hướng dẫn và truyền đạt cho tôi những kiến thức và kinh nghiệm quý báu nhất trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện luận án này. Sự nhiệt huyết, quan tâm, động viên của thầy cô là động lực, là hành trang giúp em bước tiếp trên con đường hiện tại và trong tương lai. Em xin trân trọng gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS. Vũ Thị Ngọc Thanh, Nguyên Phó Trưởng Bộ môn Dược lý và PGS.TS. Nguyễn Trần Thị Giáng Hương, Nguyên Trưởng phòng Quản lý Đào tạo Đại học, Nguyên Phó Trưởng Bộ môn Dược lý đã quan tâm, tận tình giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu ngay từ những ngày đầu em về học tập tại Bộ môn. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn vô hạn tới cha mẹ, chồng, con, người thân và bạn bè đã luôn động viên, chia sẻ, giúp đỡ và luôn sát cánh bên tôi, tiếp thêm nghị lực và dành cho tôi những điều kiện thuận lợi nhất để tôi yên tâm thực hiện luận án này. Hà Nội, ngày tháng 3 năm 2023 Bùi Thị Quỳnh Nhung LỜI CAM ĐOAN Tôi là Bùi Thị Quỳnh Nhung, nghiên cứu sinh khóa 33, Trường Đại học Y Hà Nội, chuyên ngành: Dược lý và Độc chất, xin cam đoan: 1. Đây là luận án do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Phạm Thị Vân Anh và PGS.TS. Nguyễn Trọng Thông. 2. Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã được công bố tại Việt Nam. 3. Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung thực và khách quan, đã được xác nhận và chấp thuận của cơ sở nơi nghiên cứu. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này. Hà Nội, ngày tháng 3 năm 2023 Người viết cam đoan Bùi Thị Quỳnh Nhung DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT - ADR : Adverse Drug Reaction - AST : Aspartat aminotransferase - ALT : Alanin aminotransferase - ATP : Adenosine Triphosphate - CAT : Catalase - CCl4 : Carbon tetraclorid - DNA : Deoxyribonucleic acid - ECM : Extra cellular matrix (chất nền ngoại bào). - GSH : Glutathion - GR : Glutathion reductase - GPx : Glutathion peroxidase - LD50 : Lethal dose 50% (liều chết 50%) - MDA : Malonyl dialdehyd - NAD : Nicotinamid adenin dinucleotid - NAPQI : N-acetyl-p-benzoquinon imin - PAR : Paracetamol - SOD : Superoxide dismutase - TNF- α : Tumor necrosis factor - VGVR : Viên gan virus MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................................. DANH MỤC BẢNG .................................................................................................... DANH MỤC HÌNH ..................................................................................................... DANH MỤC BIỂU ĐỒ ............................................................................................... ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 3 1.1. Tổng quan về bệnh lý viêm gan, xơ gan ................................................................ 3 1.1.1. Cấu tạo và chức năng của gan ................................................................ 3 1.1.2. Nguyên nhân gây viêm gan ..................................................................... 4 1.1.3. Cơ chế bệnh sinh ..................................................................................... 7 1.1.4. Gan và stress oxy hóa ........................................................................... 11 1.1.5. Các dược liệu có tác dụng bảo vệ gan .................................................. 17 1.2. Mô hình nghiên cứu thuốc có tác dụng bảo vệ gan trên động vật thực nghiệm (in vivo) ............................................................................................................................ 22 1.2.1. Mô hình gây tổn thương gan bằng PAR ............................................... 23 1.2.2. Mô hình gây tổn thương gan bằng CCl4 ............................................... 24 1.3. Các phương pháp đánh giá ................................................................................... 26 1.3.1. Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa ........................................................ 26 1.3.2. Đánh giá tình trạng hoại tử tế bào gan ................................................ 27 1.3.3. Đánh giá chức năng bài tiết và khử độc của gan ................................. 29 1.3.4. Đánh giá chức năng tổng hợp của gan ................................................. 30 1.3.5. Khảo sát tình trạng viêm ....................................................................... 31 1.3.6. Đánh giá đại thể, vi thể tổn thương gan trên tiêu bản mô bệnh học .... 31 1.4. Tổng quan về Vismisco .......................................................................................... 35 1.4.1. Thành phần ............................................................................................ 35 1.4.2. Giới thiệu các dược liệu thành phần trong Vismisco ........................... 35 1.4.3. Một số nghiên cứu về tác dụng bảo vệ gan của các dược liệu thành phần Vismisco ................................................................................................. 39 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 44 2.1. Nguyên liệu nghiên cứu .......................................................................................... 44 2.2. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................................. 44 2.3. Hóa chất, thuốc, dụng cụ và thiết bị phục vụ nghiên cứu ................................. 45 2.3.1. Hóa chất, thuốc và dụng cụ phục vụ nghiên cứu .................................. 45 2.3.2. Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ........................................................ 46 2.4. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................... 46 2.4.1. Nghiên cứu độc tính .............................................................................. 46 2.4.2. Nghiên cứu tác dụng chống tổn thương gan cấp, chống viêm gan mạn, chống oxy hóa, chống viêm của Vismisco trên động vật thực nghiệm ........... 48 2.5. Địa điểm nghiên cứu ............................................................................................... 58 2.6. Xử lý số liệu ............................................................................................................. 58 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .............................................................. 59 3.1. Nghiên cứu độc tính của Vismisco trên thực nghiệm ........................................ 59 3.1.1. Độc tính cấp của Vismisco theo đường uống trên chuột nhắt trắng .... 59 3.1.2. Độc tính bán trường diễn của Vismisco theo đường uống trên chuột cống trắng ....................................................................................................... 59 3.2. Nghiên cứu tác dụng chống tổn thương gan cấp, chống viêm gan mạn, chống oxy hóa và chống viêm của Vismisco trên động vật thực nghiệm. .......................... 71 3.2.1. Nghiên cứu tác dụng chống tổn thương gan cấp của Vismisco ............ 71 3.2.2. Tác dụng chống viêm gan mạn và chống oxy hóa của Vismisco .......... 85 3.2.3. Nghiên cứu tác dụng chống viêm của Vismisco ........................................ 96 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ..................................................................................... 100 4.1. Độc tính của Vismisco trên động vật thực nghiệm ........................................... 100 4.1.1. Độc tính cấp của Vismisco theo đường uống trên chuột nhắt trắng .. 100 4.1.2. Độc tính bán trường diễn của Vismisco theo đường uống trên chuột cống trắng ..................................................................................................... 103 4.2. Tác dụng chống tổn thương gan cấp, chống viêm gan mạn, chống oxy hóa và chống viêm của Vismisco trên động vật thực nghiệm ............................................. 112 4.2.1. Tác dụng chống tổn thương gan cấp của Vismisco ............................ 112 4.2.2. Tác dụng chống viêm gan mạn và chống oxy hóa của Vismisco trên chuột nhắt trắng ............................................................................................ 125 4.2.3. Tác dụng chống viêm của Vismisco trên động vật thực nghiệm ......... 138 KẾT LUẬN ................................................................................................................... 148 KIẾN NGHỊ ........................................................................................................... 150 DANH MỤC CÁC BÀI BÁO CÔNG BỐ ................................................................. TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................... DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Tác dụng bảo vệ gan của một số dược liệu ................................ 18 Bảng 3.1. Mối tương quan giữa liều dùng Vismisco và tỉ lệ chuột chết ..... 59 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của Vismisco đến trọng lượng chuột cống trắng ..... 60 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của Vismisco đến hemoglobin và hematocrit trong máu chuột cống trắng ................................................................ 61 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của Vismisco đến thể tích trung bình hồng cầu ....... 61 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của Vismisco đến công thức bạch cầu ..................... 62 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của Vismisco đến số lượng tiểu cầu ........................ 63 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của Vismisco đến nồng độ bilirubin toàn phần ....... 64 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của Vismisco đến hàm lượng Albumin ................... 65 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của Vismisco đến nồng độ cholesterol toàn phần ... 65 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của Vismisco đến hàm lượng creatinin ................. 66 Bảng 3.11. Ảnh hưởng của Vismisco lên hoạt độ AST, ALT trong huyết thanh chuột bị gây độc bằng PAR ............................................. 72 Bảng 3.12. Ảnh hưởng của Vismisco lên hình ảnh mô bệnh học của gan chuột bị gây độc bằng PAR ...................................................... 74 Bảng 3.13. Ảnh hưởng của Vismisco lên trọng lượng chuột nhắt, lên hoạt độ AST, ALT trong huyết thanh chuột sau 2 ngày bị gây độc bằng PAR .................................................................................. 78 Bảng 3.14. Ảnh hưởng của Vismisco lên trọng lượng chuột nhắt, lên hoạt độ AST, ALT trong huyết thanh chuột sau 4 ngày bị gây độc bằng PAR .................................................................................. 79 Bảng 3.15. Ảnh hưởng của Vismisco lên hàm lượng MDA trong dịch đồng thể gan chuột nhắt bị gây độc bằng PAR .................................. 80 Bảng 3.16. Ảnh hưởng của Vismisco lên hình ảnh mô bệnh học của gan chuột bị gây độc bằng PAR ...................................................... 81 Bảng 3.17. Ảnh hưởng của Vismisco lên hoạt độ AST, ALT trong huyết thanh chuột nhắt trên mô hình gây viêm gan mạn bằng CCl4 .. 86 Bảng 3.18. Ảnh hưởng của Vismisco lên nồng độ Albumin, Cholesterol, Bilirubin trong huyết thanh chuột nhắt trên mô hình gây viêm gan mạn bằng CCl4 ................................................................... 87 Bảng 3.19. Ảnh hưởng của Vismisco lên thời gian prothrombin (PT), thời gian thromboplastin từng phần được hoạt hoá (APTT) và hàm lượng fibrinogen trong huyết thanh chuột nhắt trên mô hình gây viêm gan mạn bằng CCl4 .......................................................... 88 Bảng 3.20. Ảnh hưởng của Vismisco lên sự thay đổi hàm lượng Hydroxyprolin trong dịch đồng thể gan chuột nhắt trên mô hình gây viêm gan mạn bằng CCl4 .................................................... 89 Bảng 3.21. Ảnh hưởng của Vismisco lên sự thay đổi hoạt độ SOD, GPx trong huyết thanh chuột nhắt trên mô hình gây viêm gan mạn bằng CCl4 .................................................................................. 94 Bảng 3.22. Tác dụng chống viêm cấp của Vismisco trên mô hình gây phù lòng bàn chân chuột cống trắng bằng carrageenin .................... 96 Bảng 3.23. Ảnh hưởng của Vismisco lên thể tích dịch rỉ viêm, số lượng bạch cầu và hàm lượng protein trong dịch rỉ viêm .................... 97 Bảng 3.24. Trọng lượng trung bình u hạt thực nghiệm .............................. 98 Bảng 3.25. Ảnh hưởng của Vismisco đến số lượng bạch cầu và công thức bạch cầu của chuột nhắt trên mô hình gây viêm mạn thực nghiệm ...................................................................................... 98 Bảng 3.26. Ảnh hưởng của Vismisco lên nồng độ TNF-α huyết thanh của chuột nhắt trên mô hình gây viêm mạn thực nghiệm ................ 99 Bảng 4.1. Các nghiên cứu về độc tính cấp của dược liệu có trong Vismisco ... 102 Bảng 4.2. Các nghiên cứu về độc tính của dược liệu có trong Vismisco ......... 104 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Hạt đậu xanh (Vigna Radiata L. Wilczek) ...............................................36 Hình 1.2. Ảnh chụp cây Thổ phục linh (Smilax glabra roxb) .................................37 Hình 1.3. Ảnh chụp cây Cam thảo đất (Scoparia dulcis L.) ....................................38 Hình 3.1. Hình thái vi thể gan chuột lô chứng (chuột số 13)...................................67 Hình 3.2. Hình thái vi thể gan chuột lô trị 1 (chuột số 20) ......................................67 Hình 3.3. Hình thái vi thể gan chuột lô trị 2 (chuột số 36) ......................................68 Hình 3.4. Hình thái vi thể thận chuột lô chứng (chuột số 13) .................................69 Hình 3.5. Hình thái vi thể thận chuột lô trị 1 (chuột số 20) .....................................69 Hình 3.6. Hình thái vi thể thận chuột lô trị 2 (chuột số 36) .....................................70 Hình 3.7. Hình thái vi thể thận chuột lô trị 2 (chuột số 40) .....................................70 Hình 3.8. Hình thái vi thể gan chuột lô chứng (chuột số 6) .....................................75 Hình 3.9. Hình thái vi thể gan chuột lô mô hình (chuột số 12) ...............................75 Hình 3.10. Hình thái vi thể gan chuột lô mô hình (chuột số 6) ...............................76 Hình 3.11. Hình thái vi thể gan chuột lô uống Silymarin (chuột số 19) .................76 Hình 3.12. Hình thái vi thể gan chuột lô uống Vismisco 0,6g/kg (chuột số 34) ....77 Hình 3.13. Hình thái vi thể gan chuột lô uống Vismisco 1,8/kg (chuột số 42) ......77 Hình 3.14. Hình thái vi thể gan chuột lô chứng (chuột số 8) ..................................82 Hình 3.15. Hình thái vi thể gan chuột lô mô hình (chuột số 26) .............................82 Hình 3.16. Hình thái vi thể gan chuột lô uống Silymarin (chuột số 37) .................83 Hình 3.17. Hình thái vi thể gan chuột lô uống Vismisco 0,6g/kg (chuột số 69) ....83 Hình 3.18. Hình thái vi thể gan chuột lô uống Vismisco 0,6g/kg (chuột số 68) ....84 Hình 3.19. Hình thái vi thể gan chuột lô uống Vismisco 1,8g/kg (chuột số 51) ....84 Hình 3.20. Hình thái vi thể gan chuột lô chứng (chuột số 47) ................................91 Hình 3.21. Hình thái vi thể gan chuột lô mô hình (chuột số 5) ...............................91 Hình 3.22. Hình thái vi thể gan chuột lô uống silymarin (chuột số 37) ...............92 Hình 3.23. Hình thái vi thể gan chuột lô uống silymarin (chuột số 38) ...............92 Hình 3.24. Hình thái vi thể gan chuột lô uống Vismisco 0,6g/kg (chuột số 31) ....93 Hình 3.25. Hình thái vi thể gan chuột lô uống Vismisco 1,8g/kg (chuột số 16) ....93 Hình 4.1. Quá trình chuyển hóa Paracetamol (Acetaminophen - APAP) .......... 114 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1. Ảnh hưởng của Vismisco đến số lượng hồng cầu ................................ 60 Biểu đồ 3.2. Ảnh hưởng của Vismisco đến số lượng bạch cầu ................................ 62 Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của Vismisco đến hoạt độ AST trong máu ........................ 63 Biểu đồ 3.4. Ảnh hưởng của Vismisco đến hoạt độ ALT trong máu ....................... 64 Biểu đồ 3.5. Ảnh hưởng của Vismisco lên trọng lượng gan của chuột nhắt bị gây độc bằng PAR ............................................................................................ 71 Biểu đồ 3.6. Ảnh hưởng của Vismisco hàm lượng MDA trong dịch đồng thể gan chuột nhắt bị gây độc bằng PAR ............................................................... 73 Biểu đồ 3.7. Ảnh hưởng của Vismisco lên trọng lượng gan chuột nhắt trên mô hình gây viêm gan mạn bằng CCl4 .................................................................... 85 Biểu đồ 3.8. Ảnh hưởng của Vismisco đến mô bệnh học gan chuột trên mô hình gây viêm gan mạn bằng CCl4 ........................................................................... 90 Biểu đồ 3.9. Ảnh hưởng của Vismisco lên hàm lượng MDA trong dịch đồng thể gan chuột nhắt trên mô hình gây viêm gan mạn bằng CCl4 ............................. 95 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Tỷ lệ mắc bệnh và tử vong do các bệnh về gan ngày càng gia tăng và trở thành một thách thức lớn đối với y tế thế giới. Theo báo cáo về gánh nặng bệnh tật thế giới năm 2019, bệnh gan chiếm khoảng 2 triệu ca tử vong mỗi năm, trong đó tỷ lệ tử vong do xơ gan và ung thư gan chiếm 3,5% tổng số ca tử vong trên toàn thế giới 1. Tại Việt Nam, năm 2020, theo cơ quan nghiên cứu ung quốc tế (IARC), tỷ lệ mắc mới ung thư gan cao nhất trong các bệnh ung thư với số ca mắc mới là 26.418 (chiếm tỷ lệ 14,5% tổng số ung thư). Ung thư gan cũng là ung thư có số ca tử vong dẫn đầu với 25.272 ca (21% tổng số tử vong do ung thư), gấp 3,8 lần tổng số ca tử vong do tai nạn giao thông 2. Có nhiều nguyên nhân dẫn tới viêm gan mạn tính, xơ gan và ung thư gan như nhiễm virus, rượu, hóa chất. Cơ chế bệnh sinh của viêm gan mạn tính, đặc biệt trong trường hợp stress oxy hóa, có sự tham gia của nhi