Luận án Nghiên cứu hóa học và thăm dò hoạt tính sinh học của loài thông lá dẹt (Pinus Krempfii Lecomte) và ngũ gia bì hương (Acanthopanax Trifoliatus L. Merr.)

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN HOÁ HỌC ------------ LÊ THỊ HỒNG NHUNG NGHIÊN CỨU HÓA HỌC VÀ THĂM DÒ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA LOÀI THÔNG LÁ DẸT (PINUS KREMPFII LECOMTE) VÀ NGŨ GIA BÌ HƯƠNG (ACANTHOPANAX TRIFOLIATUS L. MERR.). LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Hà Nội – Năm 2014 2 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng có ai công bố trong các công trình nghiên cứu trước đây. Tác giả luận án Lê Thị Hồng Nhung 3 LỜI CẢM ƠN Luận án này được hoàn thành tại Phòng Tổng hợp hữu cơ, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Trong quá trình nghiên cứu, tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ chân tình của các thầy cô, các nhà khoa học cũng như đồng nghiệp, bạn bè và người thân. Với lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất, tôi xin gửi đến PGS. TS. Trịnh Thị Thủy và TS. Nguyễn Thanh Tâm – những người thầy đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, tận tình hướng dẫn và có nhiều góp ý quý báu trong thời gian thực hiện luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn GS. TSKH. Trần Văn Sung đã tạo điều kiện tốt nhất để tôi được học tập, nghiên cứu tại Phòng Tổng hợp hữu cơ và cũng là người đã ủng hộ tôi thực hiện luận án này. Tôi cũng xin cảm ơn đến các cán bộ nghiên cứu phòng Tổng hợp hữu cơ – Viện Hóa học đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực nghiệm và hoàn thành bản luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô, các nhà khoa học Viện Hóa học đã giảng dạy, hướng dẫn tôi hoàn thành các học phần và các chuyên đề trong chương trình đào tạo. Tôi trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học Công nghiệp Hà Nội cùng Ban lãnh đạo Viện Hóa học đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian học tập. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến toàn thể gia đình, đồng nghiệp và bạn bè đã ủng hộ và động viên tôi hoàn thành tốt luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn! Hà nội, ngày. tháng năm 2014 Tác giả luận án 4 MỤC LỤC DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ..... v DANH MỤC CÁC HÌNH ...........vi DANH MỤC CÁC BẢNG..... iix DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮTix MỞ ĐẦU....... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ............................................................................. 3 1.1. Tổng quan về hai loài nghiên cứu .............................................................. 3 1.1.1. Loài Thông lá dẹt (Pinus krempfii Lecomte) .............................................. 3 1.1.1.1. Đặc điểm thực vật loài Thông lá dẹt ................................................. 3 1.1.1.2. Tình hình nghiên cứu loài Thông lá dẹt ............................................ 4 1.1.1.3. Tình hình nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của chi Pinus ... 5 1.1.2. Loài Ngũ gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus L.Merr.) ....................... 8 1.1.2.1. Đặc điểm thực vật loài Ngũ gia bì hương ......................................... 8 1.1.2.2. Ứng dụng trong y học dân gian của loài Ngũ gia bì hương ............... 9 1.1.2.3. Tình hình nghiên cứu của loài Ngũ gia bì hương .............................. 9 1.2. Các hợp chất flavonoid ............................................................................ 14 1.2.1. Cấu trúc hóa học ..................................................................................... 14 1.2.2. Hoạt tính sinh học ................................................................................... 16 1.3. Các hợp chất triterpene khung lupane ................................................... 19 1.3.1. Cấu trúc hóa học ..................................................................................... 19 1.3.2. Hoạt tính sinh học ................................................................................... 19 1.4. Chuyển hóa hóa học hợp chất triterpene khung lupane và hoạt tính sinh học của chúng .................................................................................................. 22 1.4.1. Chuyển hóa nhóm OH ............................................................................. 22 1.4.1.1. Chuyển hóa thành ester .................................................................. 22 1.4.1.2. Chuyển hoá thành ketone, acid, oxime, amine ................................ 24 1.4.1.3. Chuyển hóa thành carbamate ......................................................... 26 1.4.2. Chuyển hoá nhóm isopropenyl ................................................................ 27 5 1.4.2.1. Khử hoá nối đôi ∆ 20(29) ............................................................... 27 1.4.2.2. Oxy hoá nối đôi ∆ 20(29) .............................................................. 28 1.4.2.3. Chuyển hoá ở vị trí allyl của nối đôi .............................................. 28 1.4.3. Chuyển hóa nhóm 28-COOH .................................................................. 29 1.4.3.1. Chuyển hóa thành ester .................................................................. 29 1.4.3.2. Chuyển hóa thành amide ................................................................ 30 CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................................................................. 32 2.1. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị ............................................................. 32 2.1.1. Nguyên liệu ............................................................................................. 32 2.1.2. Hóa chất ................................................................................................. 32 2.1.3. Thiết bị .................................................................................................... 32 2.2. Phương pháp nghiên cứu ......................................................................... 33 2.2.1.Phương pháp chiết tách ........................................................................... 33 2.2.1.1. Phương pháp chiết tách các chất từ loài Thông lá dẹt ..................... 33 2.2.1.2. Phương pháp chiết tách các chất từ loài Ngũ gia bì hương ............. 34 2.2.2.Phương pháp xác định cấu trúc ................................................................ 34 2.2.3.Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học ................................................ 35 2.2.3.1. Hoạt tính kháng chủng Bacillus subtilis ........................................ 35 2.2.3.2. Hoạt tính gây độc tế bào ................................................................ 35 2.2.3.3. Hoạt tính chống oxi hóa ................................................................. 37 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM ...................................................................... 39 3.1. Loài Thông lá dẹt (Pinus krempfii Lecomte) ........................................... 38 3.1.1. Cặn chiết n-hexane .................................................................................. 40 3.1.2. Cặn chiết ethyl acetate (EtOAc) .............................................................. 40 3.1.2.1. Phân lập chất .................................................................................. 40 3.1.2.2. Dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập được .................................. 42 3.1.3. Cặn chiết n-buthanol (n-BuOH) .............................................................. 43 3.2. Loài Ngũ gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus (L.) Merr.) ................ 45 3.2.1. Phân lập các hợp chất từ loài Ngũ gia bì hương ..................................... 45 6 3.2.1.1. Quá trình phân lập.......................................................................... 45 3.2.1.2. Dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập được .................................. 48 3.2.2. Tổng hợp các dẫn xuất của hai chất AT1, AT2 ....................................... 48 3.2.2.1. Tổng hợp các dẫn xuất của chất AT1 ............................................. 48 3.2.2.2. Tổng hợp các dẫn xuất của chất AT2 ............................................. 57 CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 64 4.1. Kết quả từ loài Thông lá dẹt (Pinus krempfii Lecomte).......................... 64 4.1.1. Thành phần hóa học của cặn n-hexane ................................................... 64 4.1.2. Các chất phân lập được từ cặn EtOAc .................................................... 65 4.1.2.1. Tectochrysin (PK1) ....................................................................... 65 4.1.2.2. Pinostrobin (PK2) .......................................................................... 68 4.1.2.3. Pinobanksin (PK3) ........................................................................ 71 4.1.2.4. Galangin (PK4) ............................................................................. 75 4.1.2.5. Strobopinin (PK5) ......................................................................... 78 4.1.2.6. Crytostrobin (PK6) ........................................................................ 82 4.1.3. Chất phân lập được từ cặn chiết n-BuOH ............................................... 85 4.2. Kết quả từ loài Ngũ gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus L. Merr.) . 92 4.2.1. Các hợp chất được phân lập và xác định từ loài Ngũ gia bì hương. ........ 92 4.2.1.1. 24-nor-11α-hydroxy-3-oxo-lup-20(29)-ene-28-oic acid (AT1) ...... 92 4.2.1.2. 24-nor-3α,11α dihydroxy-lup-20(29)-ene-28-oic acid (AT2) ......... 95 4.2.1.3. 11α,23-dihydroxy-3-oxo-lup-20(29)-ene-28-oic acid (AT3) .......... 98 4.2.2. Các dẫn xuất chuyển hóa hóa học của hợp chất AT1, AT2 ................... 105 4.2.2.1. Các dẫn xuất của AT1 .................................................................. 106 4.2.2.2. Các dẫn xuất của AT2 ................................................................ 112 4.3. Hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập và chuyển hóa hóa học.117 4.3.1. Hoạt tính gây độc tế bào ....................................................................... 117 4.3.2. Hoạt tính kháng chủng Bacillus subtilis ................................................ 119 4.3.3. Hoạt tính chống oxi hóa ........................................................................ 120 BẢNG TỔNG HỢP CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP VÀ CHUYỂN HÓA HOÁ HỌC TỪ HAI LOÀI NGHIÊN CỨU.......................... 122 7 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................... 128 CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .................................. 130 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH ........... 132 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 133 PHỤ LỤC 8 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Trang Sơ đồ 1.1 Ester hoá acid betulinic ở vị trí 3b-OH tạo các hợp chất 56.1–56.8 22 Sơ đồ 1.2 Ester hoá betulinic acid ở vị trí 3b-OH tạo hợp chất 57 23 Sơ đồ 1.3 Chuyển hóa nhóm 3b-OH, 28-OH của betulin 23 Sơ đồ 1.4 Chuyển hóa nhóm 28-OH của betulin tạo dẫn xuất 64, 65 24 Sơ đồ 1.5 Chuyển hoá nhóm 3b-OH của betulinic acid thành ketone, oxime, amine. 25 Sơ đồ 1.6 Tổng hợp acid betulinic từ betulin 25 Sơ đồ 1.7 Tổng hợp các dẫn xuất carbamate của betulinic acid 26 Sơ đồ 1.8 Chuyển hóa các dẫn xuất carbamate của betulin 27 Sơ đồ 1.9 Khử hoá nối đôi D 20(29) của betulinic acid 27 Sơ đồ 1.10 Oxi hóa nối đôi D 20(29) của betulinic acid 28 Sơ đồ 1.11 Chuyển hóa vị trí allyl của nối đôi tạo hợp chất 85- 87 29 Sơ đồ 1.12 Tổng hợp một số dẫn xuất este của 23-hydroxy betulinic acid 30 Sơ đồ 1.13 Tổng hợp dẫn xuất A43-D của betulinic acid 31 Sơ đồ 3.1 Quy trình chiết rễ Thông lá dẹt 39 Sơ đồ 3.2 Phân lập các chất từ cặn chiết EtOAc của rễ Thông lá dẹt 41 Sơ đồ 3.3 Phân lập chất PK7 từ cặn chiết n-BuOH của rễ Thông lá dẹt 44 Sơ đồ 3.4 Quy trình chiết mẫu Ngũ gia bì hương 45 Sơ đồ 3.5 Phân lập các hợp chất từ cặn chiết dichlorometan của loài Ngũ gia bì hương 47 Sơ đồ 4.1 Tổng hợp các dẫn xuất của chất AT1 106 Sơ đồ 4.2 Tổng hợp các dẫn xuất của chất AT2 112 9 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Ảnh cây và tiêu bản của loài Thông lá dẹt 4 Hình 1.2 Hình ảnh về loài Ngũ gia bì hương 8 Hình 1.3 Vòng benzopyrano của hợp chất flavonoid 14 Hình 4.1 Phổ khối ESI-MS (positive) của chất PK1 67 Hình 4.2. Phổ 1H-NMR của chất PK1 (500 MHz, DMSO-d6) 67 Hình 4.3 Phổ 13C-NMR và DEPT của chất PK1 (125 MHz, DMSO-d6) 68 Hình 4.4 Phổ 1H-NMR của chất PK2 (500 MHz, CD3OD) 70 Hình 4.5 Phổ 1H-NMR (giãn) của chất PK2 (500 MHz, CD3OD) 70 Hình 4.6 Phổ 13C-NMR và DEPT của chất PK2 (125 MHz, CD3OD) 71 Hình 4.7 Phổ khối FT-IR của chất PK3 73 Hình 4.8 Phổ khối ESI-MS (positive ion) của chất PK3 73 Hình 4.9 Phổ 1H-NMR của chất PK3 (500 MHz, CD3OD) 74 Hình 4.10 Phổ 1H-NMR (giãn) của chất PK3 (500 MHz, CD3OD) 74 Hình 4.11 Phổ 13C-NMR của chất PK3 (125 MHz, CD3OD) 75 Hình 4.12 Phổ ESI-MS (positive ion) của chất PK4 77 Hình 4.13 Phổ 1H-NMR của chất PK4(500 MHz, CD3OD) 77 Hình 4.14 Phổ 13C-NMR của chất PK4 (125 MHz, CD3OD) 78 Hình 4.15 Phổ FT-IR của chất PK5 80 Hình 4.16 Phổ 1H-NMR của chất PK5 (500 MHz, CD3OD) 81 Hình 4.17 Phổ 1H-NMR (giãn) của chất PK5 (500 MHz, CD3OD) 81 Hình 4.18 Phổ 13C-NMR và DEPT của chất PK5 (125 MHz, CD3OD) 82 Hình 4.19 Phổ 1H-NMR của chất PK6 (500MHz, CD3OD) 84 Hình 4.20 Phổ 1H-NMR (giãn) của chất PK6 (500MHz, CD3OD) 84 Hình 4.21 Phổ 13C-NMR và DEPT của chất PK6 (125MHz, CD3OD) 85 Hình 4.22 Một số tương tác chính trong phổ HMBC của chất PK7 86 Hình 4.23 Một số tương tác chính trong phổ NOESY của chất PK7 87 Hình 4.24 Chất burselignan (PK7a) 87 10 Hình 4.25 Phổ HR-ESI-MS (positive ion) của chất PK7 88 Hình 4.26 Phổ 1H NMR của chất PK7 (500 MHz, CD3OD) 89 Hình 4.27 Phổ 13C và DEPT của chất PK7 (125 MHz, CD3OD) 89 Hình 4.28 Phổ HSQC của chất PK7 90 Hình 4.29 Phổ HMBC của chất PK7 90 Hình 4.30 Phổ NOESY của chất PK7 91 Hình 4.31 Phổ khối ESI-MS (positive ion) của chất AT1 94 Hình 4.32 Phổ 1H-NMR của chất AT1 (500 MHz, CDCl3) 94 Hình 4.33 Phổ 13C-NMR và DEPT của chất AT1 (125MHz, CDCl3) 95 Hình 4.34 Phổ ESI-MS (positive ion) của chất AT2 97 Hình 4.35 Phổ 1H-NMR của chất AT2 (500 MHz, CDCl3) 97 Hình 4.36 Phổ 13C-NMR và DEPT của chất AT2 (125MHz, CDCl3) 98 Hình 4.37 Các tương tác chính trên phổ COSY, HMBC của chất AT3 100 Hình 4.38 Phổ FT- IR của chất AT3 101 Hình 4.39 Phổ HR-ESI-MS (positive ion) của chất AT3 101 Hình 4.40 Phổ 1H-NMR của chất AT3 (500 MHz, CD3OD) 102 Hình 4.41 Phổ 1H-NMR (giãn) của chất AT3 (500 MHz, CD3OD) 102 Hình 4.42 Phổ 13C-NMR và DEPT của chất AT3 (125 MHz, CD3OD) 103 Hình 4.43 Phổ HSQC của chất AT3 103 Hình 4.44 Phổ HMBC của chất AT3 104 Hình 4.45 Phổ COSY của chất AT3 104 11 DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Một số thành phần thường có trong tinh dầu, nhựa của chi Pinus 6 Bảng 1.2 Một số terpene tiêu biểu được phân lập từ thân gỗ của chi Pinus 7 Bảng 1.3 Một số khung flavonoid thường gặp 15 Bảng 3.1 Các thông số của phản ứng chuyển hóa tạo AT6, AT7 50 Bảng 3.2 Các thông số của phản ứng chuyển hóa tạo AT10 – AT12 52 Bảng 3.3 Các thông số của phản ứng chuyển hóa tạo AT15 – AT17 55 Bảng 3.4 Các thông số của phản ứng chuyển hóa tạo AT20 – AT23 58 Bảng 4.1 Kết quả phân tích thành phần hóa học của cặn chiết n- hexane bằng phương pháp GC-MS 64 Bảng 4.2 Số liệu phổ 1H-, 13C-NMR của PK1 và tectochrysin 66 Bảng 4.3 Số liệu phổ 1H, 13C-NMR của PK2 và pinostrobin 69 Bảng 4.4 Số liệu phổ 1H, 13C-NMR của PK3 và số liệu của pinobanksin 72 Bảng 4.5 Số liệu phổ 1H, 13C-NMR của PK4 76 Bảng 4.6 Số liệu phổ 1H-, 13C-NMR của PK5 và (2S)-Strobopinin 79 Bảng 4.7 Số liệu phổ 1H-, 13C-NMR của PK6 và (2S)-Cryptostrobin 83 Bảng 4.8 Số liệu phổ 1H, 13C-NMR của PK7, (+)-Isolariciresinol và Burselignan 87 Bảng 4.9 Số liệu phổ 1H-, 13C-NMR của AT1 và 24-nor-11α-hydroxy- 3-oxo-lup-20(29)-ene-28-oic acid 93 Bảng 4.10 Số liệu phổ 1H-, 13C-NMR của AT1 và 24-nor-3α,11α dihydroxy-lup-20(29)-ene-28-oic acid 96 Bảng 4.11 Số liệu phổ 1H, 13C-NMR của AT3 (CD3OD, 500/125MHz) 99 Bảng 4.12 Kết quả hoạt tính gây độc tế bào 117 12 Bảng 4.13 Kết quả hoạt tính kháng chủng Bacillus subtilis 119 Bảng 4.14 Kết quả hoạt tính chống oxi hóa theo phương pháp DPPH 120 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 1H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 13C- NMR Carbon -13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer Phổ DEPT HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation Phổ tương tác đa liên kết hai chiều dị hạt nhân HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence Phổ tương tác hai chiều trực tiếp dị hạt nhân 1H-1H- COSY 1H-1H- Correlation Spectroscopy Phổ tương tác hai chiều đồng hạt nhân 1H-1H ESI-MS Electron Spray Ionization-Mass Spectroscopy Phổ khối ion hóa bằng phun mù điện tử HR-ESI- MS High Resolution Electron Spray Ionization Mass Spectroscopy Phổ khối phân giải cao ion hóa bằng phun mù điện tử FT-IR Infrared Spectroscopy Phổ hồng ngoại s singlet d doublet t triplet q quartet dd doublet of doublet dt doublet of triplet br broad m multiplet J (Hz) Hằng số tương tác (Hz) 13 δ (ppm) (ppm = part per million) Độ dịch chuyển hóa học tính bằng ppm (phần triệu) CC Column Chromatography Sắc ký cột SKLM Sắc ký lớp mỏng KB Human epidermoid carcinoma Ung thư biểu mô Hep-G2 Hepatocellular carcinoma human Ung thư gan người MCF-7 Adeno carcinoma Ung thư vú Lu Human lung carcinoma Ung thư phổi RD Human rhabdomyosarcoma Ung thư màng tim TPA 12-O-Tetradecanoylphorbol-13- acetate IC50 Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế 50% tế bào thử nghiệm EC50 Effective concentration 50% Liều có hiệu quả trên 50% tế bào thử nghiệm MIC Minimum inhibitory concentration Nồng độ ức chế tối thiểu Ac CH3CO- Acetyl Me -CH3 Methyl Bu -C4H9 Butyl Et -C2H5 Ethyl DMSO Dimetylsunfoxit TMS Tetrametyl Silan 4-DMAP 4-dimetylaminopyridin THF Tetrahydrofuran TEA Triethylamine AZT Azidothymidine TBDPSCl Tert-Butyldiphenylchlorosilane DIBALH Diisobutylaluminium hydride EDCI 1-Ethyl-3-(3- 14 dimethylaminopropyl)carbodiimide PL Phụ lục rt Room temperature Nhiệt độ phòng H hiệu suất phản ứng Rf Retention factor [αD] Năng suất quay cực LSP Lượng sản phẩm CTPT Công thức phân tử KLPT Khối lượng phân tử 15 16 MỞ ĐẦU Y học cổ truyền phương Đông có một lịch sử lâu đời và là một kho tàng y dược phong phú từ hàng nghìn năm. Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật nói chung, y học nói riêng, nền y học cổ truyền đang có những đóng góp to lớn vào việc phòng và chữa bệnh, làm tăng tuổi thọ của con người và nâng cao chất lượng cuộc sống. Nhiều hợp chất hóa học có nguồn gốc từ thiên nhiên được sử dụng làm thuốc có hiệu quả như atermisinin từ cây Thanh hao hoa vàng (Artemisia annua L.) làm thuốc chống sốt rét diệt thể phân liệt, taxol từ cây Thông đỏ (Taxus Cuspidata) được sử dụng làm thuốc chống ung thưNgoài ra, người ta còn có thể sử dụng dịch chiết của thảo dược làm thực phẩm chức năng trong việc hỗ trợ chữa bệnh như dịch chiết từ cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium) là thuốc điều trị phì đại lành tính tuyến tiền liệt (u xơ tuyến tiền liệt) ở nam giới và u xơ tử cung ở nữ giới, hay gần đây là sản phẩm từ dịch chiết của 7 loại thảo dược quý (Khổ qua, Dây thìa canh, Hoài sơn, Sinh địa, Thương truật, Linh chi và tảo Spirulina) có khả năng điều trị đái tháo đường Với những kết quả đạt được cho thấy việc nghiên cứu thành phần hóa học từ những cây cỏ thiên nhiên có một ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao, đặc biệt ở Việt Nam, một nước có thảm thực vật phong phú, có nguồn tài nguyên dược liệu vô cùng quý giá. Ngoài việc phân lập các hợp chất tro