Luận án Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài ngọc cẩu (balanophora laxiflora hemsl.) và vú bò

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẦN ĐỨC ĐẠI NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA HAI LOÀI NGỌC CẨU (BALANOPHORA LAXIFLORA HEMSL.) VÀ VÚ BÒ (FICUS HIRTA VAHL.) LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Hà Nội - 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẦN ĐỨC ĐẠI NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA HAI LOÀI NGỌC CẨU (BALANOPHORA LAXIFLORA HEMSL.) VÀ VÚ BÒ (FICUS HIRTA VAHL.) LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Chuyên ngành: Hóa học H c Mã số: 62.44.01.14 Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Trịnh Thị Thủy 2. TS. Ng yễn Q yết Tiến Hà Nội-2018 LỜI CẢM ƠN Luận án này được hoàn thành tại Phòng Nghiên cứu Hợp chất thiên nhiên và Phòng Nghiên cứu Hoạt chất sinh học,Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Trịnh Thị Thủy và TS. Nguyễn Quyết Tiến - những thầy cô đã dành cho tôi sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình trong suốt quá trình thực hiện luận án. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến các cô chú, anh chị Phòng Hợp chất thiên nhiên và Phòng Hoạt chất sinh học - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã hết lòng chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận án. Để hoàn thành luận án này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ hết sức nhiệt tình của: - Ban lãnh đạo, Thầy Cô giáo, các anh chị và các bạn đồng nghiệp tại Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. - Ban lãnh đạo, các đồng nghiệp Trường Đại học Tân Trào - Tuyên Quang. - Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đối với sự động viên, giúp đỡ của gia đình, bạn bè. - Quỹ Nafosted; Tôi xin trân trọng cảm n ! Hà Nội, ngày.......tháng.....năm 2018 Tác giả l ận án Trần Đức Đại LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Trịnh Thị Thủy và TS. Nguyễn Quyết Tiến. Các số liệu và kết quả nêu trong luận án này là trung thực, được đồng tác giả cho phép sử dụng và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả Trần Đức Đại MỤC LỤC MỞ ĐẦU ...................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ...................................................................................... 3 1.1. Giới thiệ về loài ngọc cẩ (Balanophora laxiflora Hemsl.) .......................... 3 1.1.1. Chi Balanophora .......................................................................................... 3 1.1.2. Loài ngọc cẩu B. laxiflora ........................................................................... 3 1.1.2.1. Tên gọi .................................................................................................... 3 1.1.2.2. Đặc điểm thực vật loài ngọc cẩu (B. laxiflora) .................................... 4 1.1.2.3. Công dụng chữa bệnh của loài ngọc cẩu (B. laxiflora) ......................... 5 1.1.2.4. Tổng quan của loài ngọc cẩu .................................................................. 6 1.2. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài th ộc chi Ficus . 15 1.2.1. Chi Ficus .................................................................................................... 15 1.2.1.1. Các nghiên cứu quốc tế ........................................................................ 16 1.2.1.2. Các nghiên cứu trong nước .................................................................. 32 1.2.2. Loài vú bò F. hirta ..................................................................................... 34 1.2.2.1. Mô tả thực vật ....................................................................................... 34 1.2.2.2. Công dụng ............................................................................................. 35 1.2.2.3. Thành phần hóa học loài vú bò ............................................................ 36 CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM .............. 38 2.1. Mẫ nghiên cứ ............................................................................................. 38 2.1.1. Mẫu cây ngọc cẩu ...................................................................................... 38 2.1.2. Mẫu cây vú bò ............................................................................................ 38 2.2. Phư ng pháp nghiên cứ .............................................................................. 39 2.2.1. Phương pháp chiết mẫu thực vật .............................................................. 39 2.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc ................................................................ 40 2.2.4. Phương pháp thử hoạt tính sinh học ........................................................ 40 2.2.4.1. Phương pháp nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào .............................. 40 2.2.4.2. Phương pháp gây độc tế bào thự hiện tại Đại học Y Perugia - Đại học tổng hợp Perugia nước Cộng hòa Italy ............................................................. 42 2.2.4.3. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính ức chế nitric oxide (NOs inhibition) thực hiện tại Viện Hóa học – Viện Hàn lâm và Khoa học Việt Nam43 2.3. Chiết tách và tinh chế các hợp chất từ hai loài nghiên cứ ....................... 45 2.3.1. Phân lập các hợp chất từ loài ngọc cẩu (B. laxiflora) ............................. 45 2.3.1.1.Chiết tách, tạo cao chiết ........................................................................ 45 2.3.1.2. Phân lập các hợp chất từ cặn chiết dichloromethane .......................... 46 2.3.1.3. Phân lập các hợp chất từ cặn chiết ethyl acetate ................................. 49 2.3.1.4. Phân lập các hợp chất từ cặn chiết methanol ...................................... 52 2.3.2. Phân lập các hợp chất từ rễ cây vú bò (F. hirta) ..................................... 54 2.3.2.1. Chiết mẫu, tạo cao chiết ....................................................................... 54 2.3.2.2. Thử hoạt tính các cao chiết ................................................................... 55 2.3.2.3. Phân lập các hợp chất từ cao ethyl acetate .......................................... 56 2.3.2.4. Phân lập các hợp chất từ cao n-butanol ............................................... 58 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ THẢO LUẬN ................................................................. 62 3.1. Cây ngọc cẩ (B. laxiflora) ............................................................................ 62 3.1.1. Hợp chất BL-1 (4-Hydroxy-3-methoxycinnamandehid) .......................... 62 3.1.2. Hợp chất BL-2 (methyl 4-hydroxycinnamate) .......................................... 63 3.1.3. Hợp chất BL-3 (pinoresinol) ..................................................................... 63 3.1.4. Hợp chất BL-4 (methyl 3,4-dihydroxycinnamate) .................................... 64 3.1.5. Hợp chất BL-5 (7-hydroxy-6-methoxycoumarin), scopoletin. ................. 65 3.1.6. Hợp chất BL-6 (+)-lariciresinol) ............................................................... 66 3.1.7. Hợp chất BL-7 (+)-isolariciresinol ........................................................... 68 3.1.8. Hợp chất BL-8 (quercetin) ........................................................................ 68 3.1.9. Hợp chất BL-9 (methyl gallate) ................................................................. 70 3.1.10. Hợp chất BL-10 (chất mới)- balanochalcone. ........................................ 70 3.1.11. Hợp chất BL-11 (β-hydroxydihydrochalcone) ....................................... 74 3.1.12. Hợp chất BL-12, dimethyl 6,9,10-trihydroxybenzo[kl]xanthene-1,2- dicarboxylate. ....................................................................................................... 76 3.1.13. Hợp chất BL-13 (p-cumaric acid) .......................................................... 77 3.1.14. Hợp chất BL-14 (isolariciresinol 4-O-β-D-glucopyranoside) ................ 78 3.1.15. Hợp chất BL-15 (Daucosterol) ................................................................ 78 3.1.16. Hợp chất BL-16 (5-Hydroxymethylfurfural) .......................................... 79 3.1.17. Hợp chất BL-17 (methyl β-D-glucopyranoside) ..................................... 80 3.1.18. Hợp chất BL-18 (methyl 4-O-β-D-glucopyranosylconiferyl ether) ....... 81 3.1.19. Hợp chất BL-19, 4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzoyl glucopyranoside. .. 82 3.1.20. Hợp chất BL-20 (lariciresinol 4-O-β-D-glucopyranoside) .................... 84 3.2. Các hợp chất phân lập từ loài vú bò ........................................................... .87 3.2.1. Hợp chất F-1 (6,7-Furano-hydrocoumaric acid ethyl ester) ................... 87 3.2.2. Hợp chất F-2 (umbelliferon) 7-hydroxycoumarin ................................... 90 3.2.3. Hợp chất F-3 (bergapten) .......................................................................... 92 3.2.4. Hợp chất F-4 (ethyl β-D-fructofuranoside) .............................................. 94 3.2.5. Hợp chất F-5 (ethyl β-D-glucopyranoside) .............................................. 94 3.2.6. Hợp chất F-6, 5-O-[β-D-apiofuranosyl-(1→2)-β-D- glucopyranosyl]bergaptol (chất mới) .................................................................. 95 3.2.7. Hợp chất F-7 (adenosine) ........................................................................ 101 3.2.8. Hợp chất F-8 (6-carboxy-umbelliferon) ................................................. 104 3.2.9. Hợp chất F-9 (picraquassioside A) ......................................................... 104 3.2.10. Hợp chất F-10 (rutin) ............................................................................ 105 3.2.11. Hợp chất F-11 (acid aspartic) ............................................................... 107 3.3. Kết q ả thử hoạt tính sinh học ................................................................... 109 3.3.1. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào loài ngọc cẩu (B. laxiflora) ........ 109 3.3.1.1. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào thực hiện thử nghiệm tại viện Hóa học ............................................................................................................ 109 3.3.1.2. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào thực hiện thử nghiệm ở Đại học y Perugia - Đại học tổng hợp Perugia nước Cộng hòa Italy ............................. 109 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................ 113 1. Thành phần hóa học cây ngọc cẩ B. laxiflora ............................................ 113 2. Thành phần hóa học cây vú bò F. hirta ........................................................ 113 3. Đánh giá bước đầ về hoạt tính sinh học ..................................................... 114 3.1. Hoạt tính sinh học loài ngọc cẩu B. laxifloraError! Bookmark not defined. 3.2. Hoạt tính sinh học loài vú bò F. hirta ......... Error! Bookmark not defined. DANH MỤC CÁC CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI LUẬN ÁN ........................................................................................................ 116 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 1162 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 1 H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectrocopy Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 13 C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectrocopy Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer Phổ DEPT HMBC Heteronuclear Multiple Bond Coherence Phổ tương tác dị nhân đa liên kết HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence Phổ tương tác dị nhân đơn liên kết COSY Correlation Spectrocopy Phổ tương quan proton-proton ESI-MS Electron Spray Ionization Mass Spectrocopy Phổ khối ion hóa bằng phun mù điện tử HR-ESI-MS High Resolution Electron Spray Ionization- Mass Spectrocopy Phổ khối phân giải cao ion hóa bằng phun mù điện tử NOESY Nuclear Overhauser Effect Spectrocopy Hiệu ứng NOE IR Infrared Spectrocopy Phổ hồng ngoại IC50 Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế 50% tế bào thử nghiệm KB Human epidermic carcinoma Ung thư biểu mô ở người HepG2 Human hepatocellular carcinoma Ung thư gan ở người Lu Human lung carcinoma Ung thư phổi ở người MCF-7 Human breast carcinoma Ung thư vú ở người MKN7 Human gastric cancer Ung thư dạ dày ở người LNCaP Human prostate edenocarcinoma Ung thư tuyến tiền liệt ở người HL-60 Human promyeloccytic leukemia Ung thư máu cấp tính ở người SK-Mel2 Human malignant melanoma Ung thư da ở người SW626 Human ovarian adenocarcinoma Ung thư buồng trứng ở người SW480 Human colon adenocarcinoma Ung thư đại tràng ở người RD Human rhabdomyosarcoma Ung thư cơ vân ở người IL-6 Interleukin 6 Pleiotropic cytokine TNF-α Tumor necrosis factor alpha Yếu tố hoại tử khối u HEPES Acid 4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl LPS Lipopolysaccharides L-NMMA N G -methyl-L-arginine acetate ATCC American Type Culture Collection Bảo tàng giống chuẩn Hoa Kỳ SRB Sulforhodamine B s Singlet br s Broad singlet d Doublet t Triplet m Multiplet dd Doublet of doublet J Coupling constant Hằng số tương tác (Hz) δ Độ dịch chuyển hóa học, thang δ ((ppm)) H n-hexane D Dichloromethane EtOAc Ethyl acetate MeOH Methanol DMSO Dimethyl sulfoxide n-BuOH n-butanol H:E n-hexane : ethyl acetate D:M Dichloromethane : Methanol DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Bảng thử hoạt tính của các dịch chiết loài B.laxiflora [29] ......................... 6 Bảng 1.2. Các hợp chất hóa học thuộc nhóm tanin được tách ra từ loài ngọc cẩu (B. laxiflora) ................................................................................................................. 8 Bảng 1.3. Các hợp chất hóa học thuộc nhóm (C6 - C3)n (phenylpropanoid) được tách ra từ loài ngọc cẩu (B. laxiflora Hemsl) ............................................................... 9 Bảng 1.4. Các hợp chất hóa học thuộc nhóm (C6 - C3)n (phenylpropanoid) được tách ra từ loài ngọc cẩu (B. laxiflora Hemsl) ............................................................. 10 Bảng 1.5. Bảng thử hoạt tính chống oxi hóa của các dịch chiết loài B.laxiflora bằng các phương pháp khử gốc tự do DPPH, superoxyd, ngăn chặn sự tạo phức của ion sắt [35] ........................................................................................................... 12 Bảng 1.6. Kết quả thử hoạt tính chống oxi hóa bằng phương pháp khử gốc tự do DPPH của 19 chất tách ra từ loài B.laxiflora [30]. ..................................................... 13 Bảng 1.7. Kết quả thử hoạt tính chống oxi hóa của loài B. laxiflora [32] ................. 13 Bảng 1.8. Kết quả thử hoạt tính kháng viêm của một số chất được tách ra từ loài loài B. laxiflora [33] ................................................................................................... 15 Bảng 1.9. Các hợp chất (46-51) phân lập từ quả của một số loài thuộc chi Ficus ..... 18 Bảng 1.10. Các hợp chất (52-61) phân lập từ quả của một số loài thuộc chi Ficus ... 19 Bảng 1.11. Các hợp chất (62-65) phân lập từ quả của một số loài thuộc chi Ficus ... 20 Bảng 1.12. Các hợp chất (66-75) thuộc nhóm chất alkaloid phân lập từ lá của một số loài thuộc chi Ficus ................................................ Error! Bookmark not defined. Bảng 1.13. Các hợp chất cumarin phân lập từ lá của một số loài thuộc chi Ficus ............. 22 Bảng 1.14. Các hợp chất flavonoid phân lập từ thân của một số loài thuộc chi Ficus ........................................................................................................................... 25 Bảng 1.15. Các hợp chất sterol phân lập từ rễ của một số loài thuộc chi Ficus......... 29 Bảng 1.16. Các hợp chất phân lập từ rễ của loài F. hirta Hemsl ............................... 37 Bảng 2.1. Khả năng ức chế sản sinh NO của các mẫu nghiên cứu ............................ 56 Bảng 2.2. Tác động của các mẫu nghiên cứu đến khả năng ức chế sự phát triển của tế bào RAW 264,7 ................................................................................................ 55 Bảng 3.1 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất BL-5 và của scopoletin [131a] ............... 65 Bảng 3.2. Dữ liệu phổ 1H và 13C-NMR của BL-6, BL-7 và các hợp chất tham khảo [CD3OD, δ ((ppm)), J (Hz)] ............................................................................... 67 Bảng 3.3. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất BL-8 và quercetin [129a] ....................... 69 Bảng 3.4. So sánh số liệu phổ của hợp chất BL-12 với hợp chất dimethyl 6,9,10- trihydroxybenzo[kl]xanthene-1,2-dicarboxylate.86 Bảng 3.5. So sánh số liệu phổ của hợp chất BLM-16 với hợp chất 5- hydroxymethylfurfural [123a] .................................................................................... 80 Bảng 3.6. So sánh số liệu phổ của hợp chất BL-18 với hợp chất methyl 4-O-β-D- glucopyranosylconiferyl ether [125] .......................................................................... 81 Bảng 3.7. Dữ liệu phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất BL-14, BL-20 và các hợp chất tham khảo [CD3OD; DMSO-d6, δ((ppm)), J (Hz)]............................................. 83 Bảng 3.8. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất F-1 và hợp chất tham khảo [132] ........... 90 Bảng 3.9. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất F-2 và hợp chất tham khảo [130] ........... 92 Bảng 3.10. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất F-3 và hợp chất tham khảo [132]........103 Bảng 3.11. Dữ liệu 1H-, 13C-NMR (500 và 125 MHz, δ/(ppm), J/Hz, trong DMSO-d6) và 1 H, 13C, HMBC các tương tác xa tiêu biểu của hợp chất F-6.................................... Bảng 3.12. So sánh tương quan phổ NMR của hợp chất F-7 với β-adenosine ........ 102 Bảng 3.13. Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất tách ra từ loài ngọc cẩu ...... 109 Bảng 3.14. Các hợp chất phân lập từ loài ngọc cẩu ... Error! Bookmark not defined. Bảng 3.15. Các hợp chất phân lập từ loài vú bò ......... Error! Bookmark not defined. DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1. Cây ngọc cẩu (B. laxiflora Hemsl.) .............................................................. 4 Hình 1.2. Cây vú bò (F. hirta Vahl.) ......................................................................... .34 Hình 2.1. Hình ảnh cây ngọc cẩu cái (B. laxiflora Hemsl.).......................................41 Hình 2.2. Hình ảnh cây vú bò (Ficus hirta Vahl.).......................................................41 Hình 2.3. Sơ đồ phân lập các cao chiết từ cây ngọc cẩu.......................................................48 Hình 2.4. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn chiết dichloromethane.........................50 Hình 2.5. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn chiết ethyl acetate.....................................53 Hình 2.6. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn chiết methanol..........................................56 Hình 2.7. Sơ đồ tổng quan phân lập các cặn chiết từ rễ cây vú bò..............................58 Hình 2.8. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn chiết EtOAc rễ cây vú bò....................60 Hình 2.9. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn chiết n-butanol..........................................62 Hình 3.1. Cấu trúc hóa học hợp chất BL-1 ................................................................. 62 Hình 3.2. Cấu trúc hóa học hợp chất BL-2 ................................................................. 63 Hình 3.3. Cấu trúc hóa học hợp chất BL-3 ................................................................. 6