Luận án Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tử
Hàng năm trên thế giới có khoảng 1,4 triệu người mắc HAV và khoảng 200 triệu người mang bệnh nhưng không thể hiện triệu chứng. HAV có thể lây truyền từ người sang người hoặc thông qua nước và thực phẩm bị ô nhiễm, đặc biệt ở NTHMV không xử lý nhiệt đủ yêu cầu. Lịch sử đã ghi nhận vụ dịch lan truyền rộng rãi nhất tại Thượng Hải, Trung Quốc vào năm 1988 với gần 300.000 trường hợp do tiêu thụ ngao đánh bắt tại vùng nước bị ô nhiễm nước thải [19]. Tại Tây Ban Nha, hai vụ dịch lớn do tiêu thụ ngao nhiễm HAV được nhập khẩu từ Peru đã được ghi nhận với số ca nhiễm lên tới 184 người năm 1999 và 100 người năm 2008. Liên quan đến hai vụ dịch này, Bộ Y tế Tây Ban Nha đã kích hoạt Hệ thống cảnh báo nhanh về thực phẩm và thức ăn chăn nuôi (RASFF) của châu Âu; hàng loạt hô hàng NTHMV từ Peru vào thời điểm đó đã được cảnh báo và cấm nhập khẩu vào châu Âu [20]. Đặc biệt, nghiên cứu của David Polo và cộng sự đánh giá nguy cơ nhiễm vi rút gây bệnh đường ruột thực hiện trên 50 mẫu NTHMV được nhập khẩu từ Ma rốc, Peru, Hàn Quốc và Việt Nam đã phát hiện tỉ lệ nhiễm HAV lên tới 50% trên các mẫu NTHMV đến từ Việt Nam [21]. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới, có trên 2,3 triệu người nhiễm HEV mỗi năm với khoảng 70.000 ca tử vong, chủ yếu liên quan đến việc sử dụng thực phẩm được thu hoạch từ các vùng có nguồn nước bị ô nhiễm với tỷ lệ cao nhất ở Đông và Nam Á [22]. Tại Trung Quốc, nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của ô nhiễm nguồn nước đến sức khỏe cộng đồng thông qua tiêu thụ NTHMV tại vịnh Bột Hải đã tìm thấy HEV trong 17,5% số mẫu thu thập [23]. Tại châu Âu, một cuộc điều tra năm 2008 trên 789 du khách trở về từ chuyến du thuyền sang Anh cho thấy có đến 195 người dương tính với vi rút HEV, trong đó 33 người có triệu chứng nhiễm trùng cấp tính. Phân tích nguyên nhân cho thấy có mối liên hệ chặt chẽ với việc tiêu thụ sò và trai đến từ vùng nước ô nhiễm tại Southampton [24]. Nghiên cứu của Rivadulla thực hiện trên 168 mẫu NTHMV tại hai vùng nuôi trồng thủy sản tại Tây Ban Nha đã phát hiện 24,4% mẫu nhiễn HEV [25]. Tương tự như NoV, HAstV thường được tìm thấy trong NTHMV được nuôi ở vùng nước ô nhiễm. Trẻ em là đối tượng có nguy cơ mắc HAstV cao nhất, theo một nghiên cứu năm 2013, có đến 3% trẻ em dưới năm tuổi mắc vi rút này nhập viện mỗi năm [26]. Một nghiên cứu khác thực hiện tại Nhật Bản, nơi có 4700 trẻ em trong độ tuổi đi học bị ảnh hưởng bởi bệnh viêm dạ dày ruột cấp tính, HAstV đã được tìm thấy trong 26% mẫu phân. Năm 2019, nghiên cứu của Diem Lan Vu và cộng sự thực hiện trên 384 mẫu bệnh phẩm tại Tây Ban Nha cho thấy tỷ lệ nhiễm HAstV chiếm 13,3% và được tìm thấy trong 66% các mẫu đồng nhiễm với các loại vi rút khác [27]. Một số nghiên cứu trên thế giới đã chỉ ra phương thức lây truyền chính của HAstV là do thực phẩm bị ô nhiễm, điển hình là NTHMV tại các vùng nước bị ô nhiễm [28]. Nghiên cứu của Vilarino và cộng sự thực hiện tại Tây Ban Nha trên 41 mẫu NTHMV đã phát hiện 12,2% mẫu nhiễm HAstV [29]. Nghiên cứu của David Polo và cộng sự trên 50 mẫu NTHMV nhập khẩu từ Ma rốc, Peru, Hàn Quốc và Việt Nam đã phát hiện HAstV trong 18% số mẫu; đáng chú ý, mẫu NTHMV nhập khẩu từ Việt Nam nhiễm HAstV cũng đồng nhiễm với HAV và NoV nhóm GI [21].
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Luận án Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tử, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
Phan Thị Thanh Hà
NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
MỘT SỐ VI RÚT CÓ NGUY CƠ CAO TRONG NHUYỄN THỂ
HAI MẢNH VỎ VÀ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC PHÂN TỬ
Ngành: Công nghệ Sinh học
Mã số: 9420201
LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. TS. Lê Quang Hòa
2. PGS. TS. Trương Tuyết Mai
Hà Nội - 2023
i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng
dẫn của TS. Lê Quang Hòa và PGS.TS Trương Tuyết Mai. Các số liệu, kết quả nêu
trong luận án là trung thực và chưa từng được các tác giả khác công bố.
TM. Tập thể hướng dẫn
TS. Lê Quang Hòa
Tác giả của luận án
Phan Thị Thanh Hà
ii
LỜI CẢM ƠN
Từ năm 2005 đến nay, trong những năm học Đại học, làm luận văn Thạc sĩ
và luận án Tiến sĩ tại Đại học Bách khoa Hà Nội thân yêu, tôi đã thu nhận được rất
nhiều kiến thức quý báu về lý thuyết cũng như thực hành nghiên cứu thuộc lĩnh
vực công nghệ Sinh học – công nghệ Thực phẩm. Tôi vô cùng biết ơn các Thầy
Cô giáo, Ban Giám đốc Đại học Bách khoa Hà Nội đã dạy dỗ, bảo ban giúp đỡ
tôi về mọi mặt.
Hoàn thành Luận án Tiến sĩ này, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS.
Lê Quang Hòa và PGS.TS Trương Tuyết Mai đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, dành
nhiều thời gian trao đổi, định hướng trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu
cũng như viết Luận án. Xin chân thành cảm ơn các Thầy Cô, các cán bộ của Trung
tâm nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học, Ban lãnh đạo Trường Hóa và
Khoa học sự sống đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi trong quá
trình thực hiện và báo cáo đề tài Luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc Viện Dinh dưỡng, lãnh đạo và
các đồng nghiệp Khoa Vi sinh vật Thực phẩm và Sinh học phân tử đã tạo điều
kiện, giúp đỡ tôi hoàn thành công việc chuyên môn được phân công.
Lời cảm ơn sâu sắc xin gửi tới Gia đình, Bạn bè luôn chia sẻ khó khăn,
động viên khích lệ tôi vượt qua mọi trở ngại để hoàn thành nhiệm vụ nghiên cứu
và học tập!
Hà Nội ngày tháng năm 2023
Nghiên cứu sinh
Phan Thị Thanh Hà
iii
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................................... I
Lời cảm ơn ................................................................................................................. II
MỤC LỤC ............................................................................................................... III
DANH MỤC CÁC HÌNH ...................................................................................... VI
DANH MỤC CÁC BẢNG ...................................................................................... VI
DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT...................................................... X
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
1. Tính cấp thiết của đề tài ...................................................................................... 1
2. Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................... 2
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ............................................................ 3
5. Tính mới của đề tài ............................................................................................. 4
TỔNG QUAN ........................................................................................................ 5 1.
1.1. Tình hình sản xuất, tiêu thụ nhuyễn thể hai mảnh vỏ và thách thức về an toàn
thực phẩm ................................................................................................................... 5
1.1.1. Tình hình sản xuất và tiêu thụ nhuyễn thể hai mảnh vỏ ............................ 5
1.1.2. Tình hình nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong nhuyễn thể
hai mảnh vỏ .......................................................................................................... 6
1.2. Đặc điểm sinh học các vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong nhuyễn thể
hai mảnh vỏ ................................................................................................................ 8
1.2.1. Norovirus ................................................................................................... 8
1.2.2. Hepatitis A virus ...................................................................................... 10
1.2.3. Hepatitis E virus ...................................................................................... 11
1.2.4. Astrovirus ................................................................................................ 12
1.3. Quy trình phát hiện và định lượng vi rút trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ .......... 13
1.3.1. Các phương pháp tách chiết RNA vi rút ................................................. 13
1.3.2. Các phương pháp xác định vi rút ............................................................. 17
1.4. Các quy trình phát hiện và định lượng vi rút trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ dựa
trên kỹ thuật Real-time RT-PCR .............................................................................. 21
1.5. Ứng dụng công nghệ MGB và LNA nhằm tăng nhiệt độ nóng chảy của bộ mồi,
mẫu dò trong phản ứng Real – time RT - PCR ........................................................ 25
1.5.1. Công nghệ MGB (Minor Groove Binders) ............................................. 26
1.5.2. Công nghệ LNA (Locked Nucleic Acids) ............................................... 27
iv
1.6. Phương pháp xác định kiểu gen vi rút ............................................................... 28
1.6.1. Kỹ thuật Nested RT - PCR ...................................................................... 28
1.6.2. Kỹ thuật giải trình tự Sanger ................................................................... 30
1.7. Tình hình nghiên cứu sự lưu hành các kiểu gen của NoV, HAV, HEV, HAstV
trên thế giới và tại Việt Nam .................................................................................... 32
1.7.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới .......................................................... 32
1.7.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam ......................................................... 35
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................... 39 2.
2.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................ 39
2.1.1. Vật liệu kiểm soát .................................................................................... 39
2.1.2. Mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ .................................................................. 39
2.1.3. Oligonucleotide ....................................................................................... 39
2.1.4. Hóa chất ................................................................................................... 43
2.1.5. Thiết bị ..................................................................................................... 43
2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................... 44
2.2.1. Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA của
HEV và HAstV từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ ....................................................... 44
2.2.2. Áp dụng quy trình đã xây dựng phát hiện và định lượng vi rút gây bệnh
truyền qua thực phẩm trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ ........................................ 52
2.2.3. Xác định kiểu gen của các chủng vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm
phát hiện được trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ ................................................... 56
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................................................................... 59 3.
3.1. Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA của HEV
từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ ....................................................................................... 59
3.1.1. Lựa chọn, hiệu chỉnh tổ hợp mồi, mẫu dò cho phản ứng Real-time RT-
PCR phát hiện HEV ........................................................................................... 59
3.1.2. Tách dòng và tổng hợp RNA mã hóa vùng gen đích của HEV bằng phiên
mã in vitro ........................................................................................................... 64
3.1.3. Tối ưu phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện RNA của HEV với chu
trình nhiêt theo tiêu chuẩn ISO 15216-1:2013 ................................................... 67
3.1.4. Xây dựng chu trình nhiệt rút gọn cho phản ứng Real-time RT-PCR phát
hiện RNA của HEV phục vụ xét nghiệm nhanh vi rút này ................................ 72
3.1.5. Đặc tính kỹ thuật của quy trình Real-time RT-PCR phát hiện, định lượng
HEV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ theo chu trình nhiệt rút gọn và chu trình
nhiệt của ISO 15216-1:2013 ............................................................................... 74
v
3.2. Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA của
HAstV từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ ........................................................................... 84
3.2.1. Lựa chọn, hiệu chỉnh tổ hợp mồi, mẫu dò cho phản ứng Real-time RT-
PCR phát hiện HAstV ........................................................................................ 84
3.2.2. Tách dòng và tổng hợp RNA mã hóa vùng gen đích của HAstV bằng
phiên mã in vitro ................................................................................................. 88
3.2.3. Tối ưu phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện RNA của HAstV với chu
trình nhiệt theo tiêu chuẩn ISO 15216-1:2013 ................................................... 89
3.2.4. Xây dựng chu trình nhiệt rút gọn cho phản ứng Real-time RT-PCR phát
hiện RNA của HAstV phục vụ xét nghiệm nhanh vi rút này ............................. 93
3.2.5. Đặc tính kỹ thuật của quy trình Real-time RT-PCR phát hiện, định lượng
HAstV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ theo chu trình nhiệt rút gọn và chu trình
nhiệt của ISO 15216-1:2013 ............................................................................... 94
3.3. Áp dụng quy trình đã xây dựng phát hiện vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm
trên nhuyễn thể hai mảnh vỏ .................................................................................. 100
3.3.1. Tình trạng nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trên nhuyễn thể
hai mảnh vỏ năm 2016 ..................................................................................... 100
3.3.2. Tình trạng nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trên nhuyễn thể
hai mảnh vỏ năm 2022 ..................................................................................... 107
3.3.3. So sánh tình trạng nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong
nhuyễn thể hai mảnh vỏ năm 2016 và năm 2022 ............................................. 113
3.4. Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các vi rút gây bệnh truyền qua thực
phẩm trên nhuyễn thể hai mảnh vỏ ......................................................................... 117
3.4.1. Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các chủng NoV phát hiện trong
nhuyễn thể hai mảnh vỏ .................................................................................... 117
3.4.2. Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các chủng HEV phát hiện trong
nhuyễn thể hai mảnh vỏ .................................................................................... 126
3.4.3. Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các chủng HAstV phát hiện
trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ .......................................................................... 129
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................... 133 4.
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN ............. 135
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 136
PHỤ LỤC 1 KẾT QUẢ BỔ TRỢ CỦA LUẬN ÁN ............................................... 1
PHỤ LỤC 2 SẢN PHẨM CỦA LUẬN ÁN .......................................................... 13
vi
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Xuất khẩu NTHMV Việt Nam 2020-2021 ................................................. 6
Hình 1.3 Cấu tạo khung đọc mở NoV ........................................................................ 9
Hình 1.4 Cấu trúc virion Hepatitis A virus .............................................................. 10
Hình 1.5 Cấu trúc hệ gen Hepatitis A virus ............................................................. 10
Hình 1.6 Cấu trúc virion Hepatitis E virus ............................................................... 11
Hình 1.7 Cấu trúc hệ gen Hepatitis E virus ............................................................. 11
Hình 1.8 Cấu trúc virion HAstV ............................................................................... 12
Hình 1.9 Cấu trúc hệ gen HAstV .............................................................................. 12
Hình 1.10 Bộ 4 mồi chính của phản ứng LAMP ...................................................... 18
Hình 1.11 Nguyên tắc phản ứng Real-time PCR ..................................................... 19
Hình 1.12 Vị trí gắn của MGB trên mẫu dò và cấu trúc hóa học của MGB ............ 26
Hình 1.13 Cấu trúc của nucleotide thông thường và của nucleotidd LNA (B) ........ 27
Hình 1.14 Nguyên lý kỹ thuật Nested RT - PCR ..................................................... 28
Hình 1.15 Nguyên lý của kỹ thuật giải trình tự Sanger ............................................ 30
Hình 2.1. Quy trình lựa chọn, hiệu chỉnh, thiết kế mồi và mẫu dò cho phản ứng
Real-time RT-PCR xác định HEV và HAstV .......................................................... 44
Hình 2.2. Quy trình tách dòng trình tự gen đại diện của HEV và HAstV................ 45
Hình 2.3. Quy trình phiên mã in vitro tạo chứng dương RNA................................. 47
Hình 2.4. Tối ưu phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện, định lượng HEV và
HAstV ...................................................................................................................... 48
Hình 2.5. Chu trình nhiệt của phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện, định lượng
HEV và HAstV ......................................................................................................... 49
Hình 2.6. Tóm tắt quy trình phát hiện và định lượng vi rút gây bệnh truyền qua thực
phẩm trong NTHMV ................................................................................................ 52
Hình 2.7. Chu trình nhiệt phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng vi
rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMV theo ISO 15216-1:2013 .......... 54
Hình 2.8. Chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR với mồi ngoài khuếch đại RNA
của NoV, HAV, HEV và HAstV trong NTHMV ..................................................... 57
Hình 2.9. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR với mồi trong để khuếch đại cDNA
của NoV, HAV, HEV và HAstV trong NTHMV ..................................................... 57
vii
Hình 3.1. Cấu trúc hệ gen chuẩn HEV của WHO (mã số AB630970) .................... 59
Hình 3.2. Đặc điểm bộ mồi của Schlosser và của Jothikumar trên trình tự gen HEV
chuẩn của WHO (mã số AB630970) ........................................................................ 60
Hình 3.3. Độ bao phủ của tổ hợp mồi, mẫu dò trong nghiên cứu của Schlosser và
Jothikumar với các hệ gen HEV công bố trên GenBank ......................................... 61
Hình 3.4. Sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen đích HEV-A trên gel agarose ........ 65
Hình 3.5. Kết quả sàng lọc PCR khuẩn lạc E. coli DH5α mang đoạn gen đích
HEV.A sau biến nạp vào vector pJET1.2 trên gel agarose 2,5%. ............................ 65
Hình 3.6. Kết quả giải trình tự một dòng plasmid pJET1.2 mang đoạn gen
HEV.A .................................................................................................. 66
Hình 3.7. Sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen đích HEV.B trên gel agarose ....... 66
Hình 3.8. Kết quả sàng lọc PCR khuẩn lạc E. coli DH5α mang đoạn gen đích
HEV.B sau biến nạp vào vector pJET1.2 trên gel agarose ....................................... 67
Hình 3.9. Kết quả giải trình tự một dòng plasmid pJET1.2 mang đoạn gen HEV.B ........ 67
Hình 3.10. Chu trình nhiệt rút gọn của phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện HEV
từ NTHMV ............................................................................................................... 74
Hình 3.11. Kết quả xác định giới hạn phát hiện với xác suất 95% (LOD95%) của
phản ứng Real-time RT-PCR xác định HEV ........................................................... 78
Hình 3.12. Kết quả xác định khoảng định lượng của phản ứng Real-time RT-PCR
phát hiện và định lượng HEV trong NTHMV .......................................................... 82
Hình 3.14. Độ bao phủ của tổ hợp mồi, mẫu dò trong nghiên cứu của Cann và cộng
sự............................................................................................................................... 85
Hình 3.15. Sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen đích HAstV trên gel agarose ...... 88
Hình 3.16. Kết quả sàng lọc PCR khuẩn lạc E. coli DH5α mang đoạn gen đích
HAstV sau biến nạp vào vector pJET1.2 trên gel agarose ....................................... 88
Hình 3.17. Kết quả giải trình tự một dòng plasmid pJET1.2 mang đoạn gen HAstV
.................................................................................................................................. 89
Hình 3.18. Kết quả xác định giới hạn phát hiện với xác suất 95% (LOD95%) của
phản ứng Real-time RT-PCR xác định HAstV sử dụng chu trình nhiệt rút gọn; sử
dụng chu trình nhiệt theo ISO .................................................................................. 96
Hình 3.19. Kết quả xác định khoảng định lượng của phản ứng Real-time RT-PCR
phát hiện và định lượng HAstV trong NTHMV sử dụng chu trình nhiệt rút gọn; sử
dụng quy trình ISO ................................................................................................... 98
viii
Hình 3.20. Các đường chuẩn định lượng của phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện
và định lượng HAstV trong NTHMV. Sử dụng chu trình nhiệt rút gọn; Sử dụng chu
trình nhiệt theo ISO .................................................................................................. 98
Hình 3.21. Kết quả phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng vi rút gây
bệnh truyền qua thực phẩm trên NTHMV năm 2016............................................. 101
Hình 3.22. Phân bố nồng độ vi rút trong các mẫu dương tính năm 2016 .............. 105
Hình 3.23. Tỉ lệ nhiễm tạp đồng thời nhiều loại vi rút gây bệnh truyền qua thực
phẩm trong NTHMV tại chợ và siêu thị năm 2016 ................................................ 106
Hình 3.24. Tỉ lệ nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMV theo
thời điểm lấy mẫu năm 2016 .................................................................................. 106
Hình 3.25. Kết quả phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng vi rút gây
bệnh truyền qua thực phẩm trên NTHMV năm 2022............................................. 108
Hình 3.26. Phân bố nồng độ vi rút trong các mẫu dương tính năm 2022 .............. 112
Hình 3.27. Tỉ lệ nhiễm tạp đồng thời nhiều loại vi rút gây bệnh truyền qua thực
phẩm trong NTHMV tại chợ và siêu thị năm 2022 ................................................ 112
Hình 3.28. Tỉ lệ nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMV theo
thời điểm lấy mẫu năm 2022 .................................
Các file đính kèm theo tài liệu này:
luan_an_nghien_cuu_xay_dung_phuong_phap_phan_tich_mot_so_vi.pdf- 2. NCS 2016_Phan Thi Thanh Ha_Tom tat.pdf
- 3. NCS 2016_Phan Thi Thanh Ha_Trich yeu.pdf
- 4. NCS 2016_Phan Thi Thanh Ha_Thong tin web.pdf
