Luận án Phân lập, tuyển chọn và ứng dụng vi khuẩn phân giải Keratin trong chăn nuôi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ QUÁCH TH TH NH T M PH N LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ ỨNG DỤNG VI KHUẨN PH N GIẢI KER TIN TRONG CHĂN NUÔI LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC Mã ngành: 62 42 01 07 CHUYÊN ĐỀ NGHIÊN CỨU SINH HÂN CẦN THƠ, 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ QUÁCH TH TH NH T M PH N LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ ỨNG DỤNG VI KHUẨN PH N GIẢI KER TIN TRONG CHĂN NUÔI LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC Mã ngành: 62 42 01 07 CHUYÊN ĐỀ NGHIÊN CỨU SINH NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHO HỌC TS B I TH MINH DI U PGS TS NGUYỄN NH T U N DUNG CẦN THƠ - 2017 i CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨ VI T NAM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc CAM KẾT KẾT QUẢ Tôi xin cam kết luận án này đƣợc hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi và các kết quả của nghiên cứu này chƣa đƣợc dùng cho bất cứ luận án cùng cấp nào khác. Cần Thơ, ngày tháng năm 2017 Nghiên cứu sinh thực hiện Quách Th Thanh T mKER TIN TỪ CHẤT NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHO HỌC 1 NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHO HỌC 2SÖC - GI CẦ TS B I TH MINH DI UM PGS.TS NGUYỄN NH T U N DUNG ii LỜI CÁM ƠN Với tất cả lòng biết ơn s u sắc, tôi xin ch n thành cám ơn TS i Th Minh iệu và PGS.TS. Nguy n Nhựt Xu n ung đã tận tình hƣớng dẫn và giúp tôi hoàn thành luận án này ô là ngƣời truyền cho tôi lòng nhiệt huyết và thổi lên ngọn lửa đam mê khoa học, khơi dậy trong tôi sự nỗ lực, tự tin, cố gắng không ngừng và không nản lòng trƣớc những khó khăn trong suốt tiến trình thực hiện luận án tiến sĩ Xin cám ơn Cô đã dành nhiều thời gian, công sức và luôn giúp tôi có đƣợc ngh lực và đ nh hƣớng đúng đắn trong học tập và nghiên cứu Tiến trình hơn 3 năm thực hiện các thí nghiệm trong luận án, tôi đã luôn đƣợc sự quan t m, hỗ trợ của an lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát triển ông nghệ Sinh học-trƣờng Đại học ần Thơ, quý Thầy ô Viện Nghiên cứu và Phát triển ông nghệ Sinh học, quý Thầy ô Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng Đại học ần Thơ, đã giúp tôi có thêm nhiều ngh lực để hoàn thành nội dung nghiên cứu Xin cám ơn: án bộ phòng Thí nghiệm chuyên s u, phòng thí nghiệm Sinh học ph n tử Viện Nghiên cứu và Phát triển ông nghệ sinh học-Trƣờng Đại học ần Thơ đã hỗ trợ tôi thực hiện nội dung nghiên cứu ạn Kim Ngọc, các bạn Nghiên cứu sinh, học viên ao học và các em Sinh viên đã đồng hành c ng tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu; đã chia s những khó khăn và khuyến khích, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu uối c ng, xin đƣợc gởi lời biết ơn đến Trƣờng ao đ ng ộng Đồng Vĩnh Long đã sắp xếp công việc và tạo điều kiện thuận lợi về thời gian để tôi hoàn thành kế hoạch học tập toàn khóa trong chƣơng trình đào tạo tiến sĩ h n thành cám ơn iii TÓM LƢỢC L ng gi s gia cầm là phế phẩm đượ t o r với khối lượng lớn từ hăn nu i và giết mổ gi s gia cầm. Với thành phần chính là keratin (90%), lông khó phân hủy và gây ảnh hưởng xấu đến m i trường. Sử dụng vi huẩn để phân hủy nguồn chất thải này đ ng là hướng đi mới, vừa có thể giải quyết vấn đề ô nhiễm m i trường l i vừa tận dụng sản phẩm để bổ sung vào thứ ăn hăn nu i ho làm ph n n sinh h Luận án bao gồm 4 nội dung với 12 thí nghiệm nhằm phân lập, tuyển ch n, định danh và khảo sát á điều kiện nuôi cấy phù hợp của các hủng vi khuẩn có khả năng ph n hủy hất thải l ng gi s gi ầm hiệu quả cao, từ đ ứng ụng ủ lông gia cầm với chủng vi khuẩn Bacillus megaterium K79 thành bột lông sinh h c dùng nuôi gà thả vườn. Tổng cộng có 429 chủng vi khuẩn hiếu khí bản địa phân hủy chất thải l ng được phân lập. Trong đ 115 hủng vi huẩn phân giải er tin được phân lập trên m i trường với bột lông gia cầm đượ ùng như nguồn carbon và nitơ uy nhất từ 42 mẫu (đất, nước và lông gia cầm) thu ở á ơ sở giết mổ gi ầm thuộc thành phố Cần Thơ, Vĩnh Long và Đồng Tháp; 225 hủng vi huẩn ng đượ ph n lập từ 126 mẫu (đất, nướ và l ng heo ở á ơ sở giết mổ gi s Đ c biệt 89 chủng vi khuẩn hịu nhiệt hiếu h hả năng ph n hủy l ng gi ầm ng được phân lập từ 23 mẫu đất và 7 mẫu nước thu t i ơ sở giết mổ và tr i hăn nu i gi ầm ở Vĩnh Long và Đồng Tháp Các hủng vi huẩn phân lập đượ đều thể hiện ho t t nh er tin se trên ơ hất azokeratin. Kết quả ph n t h hả năng ph n hủy ột l ng ho thấy 115 hủng vi huẩn ph n hủy ột l ng gi ầm đ làm giảm hối lượng ột l ng gi ầm từ 20,87% đến 84,31% s u một tuần lắ ủ ở 37o ; 225 hủng vi huẩn ph n hủy l ng heo đ làm giảm hối lượng ột l ng heo từ 6,27% đến 63,38% và 89 hủng vi huẩn hịu nhiệt ng làm giảm hối lượng ột l ng gi ầm từ 7,54% đến 66,66% Trong 429 hủng vi huẩn này, 26 hủng vi huẩn hả năng ph n hủy l ng gi s , gi ầm hiệu quả nhất đượ tuyển h n và định nh theo hệ thống ph n lo i ergey ết hợp với giải tr nh t đo n gen 16S rRN y phát sinh loài đượ v từ á tr nh t đo n gen 16S rRN ủ 26 hủng vi huẩn đượ tuyển h n đ thể hiện mối liên hệ i truyền gi h ng Ngoài r , ết quả n ho thấy phần lớn vi huẩn đượ tuyển h n thuộ lớp Bacilli (73,08% , á hủng vi huẩn n l i thuộ lớp et proteo teri (3,85% , lớp l vo teri (7,69% và lớp mm proteo teri (15,38% iv hủng vi huẩn illus meg terium K79 ph n hủy l ng gi ầm tốt nhất và hủng vi huẩn revi illus p r revis Kr110 ph n hủy l ng gi s tốt nhất đượ tuyển h n để tiếp tụ nghiên ứu về m i trường nu i ấy Kết quả nghiên ứu ho thấy hả năng ph n hủy ột l ng gi ầm ủ illus megaterium K79 và hả năng ph n hủy ột l ng heo ủ revi illus p r revis Kr110 ùng đ t hiệu quả o nhất trong m i trường nu i ấy nhiệt độ 35o và p 8,0 với nồng độ ị h vi huẩn đư vào 10% và h ột l ng là nguồn inh ư ng hứ r on và nitơ Thời gi n nu i ủ sợi l ng gi ầm nguyên với illus meg terium K79 trong 10 tuần ho ết quả ph n hủy là 100% và thời gi n nu i ủ sợi l ng heo nguyên với revi illus p r revis Kr110 trong 10 tuần ho hiệu suất ph n hủy là 38,5% Trong th nghiệm nu i gà, hủng vi huẩn illus meg terium K79 đượ ứng ụng để ủ l ng gi ầm trong 10 tuần đ t o đượ ột l ng sinh h đ t mứ n toàn vi sinh và đượ ùng như nguồn th liệu ung ấp đ m trong hẩu phần với mứ 2%, 5%, 8% ùng nu i ư ng gà thả vườn thành ng Với mứ ổ sung 5% ột l ng sinh h vào hẩu phần đ gi p gà sinh trưởng tốt, t lệ nu i sống o (100% với á h tiêu sinh trưởng và á h tiêu th n thịt tốt đ t tương đương với nghiệm thứ đối hứng T m l i, vi huẩn ph n giải er tin ản đị trong nghiên ứu này có tiềm năng ứng ụng th tế nhờ đáp ứng tốt 3 yêu ầu qu n tr ng: gi p xử lý nguồn nhiễm m i trường từ phế phẩm l ng gi s , gi ầm; gi p tái hế iến nguồn phế phẩm này thành thứ ăn ổ sung protein với giá trị inh ư ng và hả năng tiêu h o cho vật nu i; t o m i trường th n thiện Từ khoá: Bacillus megaterium, Brevibacillus parabrevis Kr110, bột lông sinh học, ch tiêu th n th t tốt, gà thả vƣờn, t l ph n hủy lông v ABSTRACT Feather and cattle hair were the waste generated in large quantity from livestock and slaughterhouses. Because their main component is keratin (90%), they are difficultly degraded and become a serious environmental pollutants. Using bacteria to decompose these wastes was a new solution to solve the environmental pollution and used the product as animal supplement feed or bio-fertilizer. This dissertation was carried out on 4 contents with 12 experiments to isolate, screen, identify and survey the suitable culture conditions of two selected keratinolytic bacteria isolates that showing the most effective capacity in feather and pig hair degradation and apply one of them for production biological feather meal as feed supplementation for raising backyard chicken. A total of 429 indigenous aerobic keratinolytic bacteria were isolated. Specifically, 115 keratinolytic bacterial strains were isolated on agar medium with feather powder used as the sole carbon and nitrogen source from 42 samples (soil, waste water and poultry feather) collecting from the poultry slaughterhouse in Can Tho city, Vinh Long and Dong Thap; 225 keratinolytic bacterial strains were also isolated from 126 samples (soil, waste water and pig hair) collecting from the cattle slaughterhouses. Especially 89 thermophilic keratinolytic strains were isolated from 23 samples of soil, 7 waste water samples collecting from the poultry processing plants and farm in Vinh Long and Dong Thap. All isolated bacteria showed keratinase activity on azokeratin. Results of feather degrading capacity analysis showing 115 strains isolated on feather powder media reduced the feather powder from 20,87% to 84,31% after shaking incubation for a week at 37°C; 225 pig hair strains revealed decomposed capacity from 6,27% to 63,38% in pig hair powder decomposition; and 89 thermophilic strains also reduced feather powder in rating from 7.54% to 66.66 %. Among these 429 keratinolytic bacteria strains, 26 isolates having the most effective degrading capacity were chosen and i entifie uil ing on ergey’s m nu l om ining 16S rRN gene sequen ing Phylogenetic tree deducing from the 16S rRNA partial gene sequences of 26 selected strains showed a genetic link between them. In addition, the identification results noticed that most belonged to Bacilli class (73,08%) and the rest strains as members of Betaproteobacteria class (3,85%), Flavobacteria class (7,69%) and Gammaproteobacteria class (15,38%). vi Bacillus megaterium K79, the best strain in decomposing feather and Brevibacillus parabrevis Kr110 as the best for decaying pig hair were chosen to study their suitable culture conditions. Results showed that the most effective feather degradation of Bacillus megaterium K79 as well as the best pig hair decomposition of Brevibacillus parabrevis Kr110 were at 35°C and pH8,0 in the medium inoculated with 10% bacteria, using feather or pig hair as the sole nitrogen and carbon source. Within 10 weeks, the intact feather incubated with Bacillus megaterium K79 was decayed 100% while Brevibacillus parabrevis Kr110 degraded 38,5% intact pig hair. In the chicken raising experiment, biological feather powder produced by incubating feathers with Bacillus megaterium K79 for 10 weeks demonstrated that this product was a microbiological safety product, which was successfully used as an alternative supplemental protein with 2%, 5% and 8% in the diet for backyard chicken. Among these diets, rate 5% showed as the best rate that the broilers got good growth with high survival rate (100%) and good carcass ratio comparing to the control. In short, the indigenous keratinolytic bacteria from this study showed high applicable potentiality by meeting to three important requirements: supporting for pollution treatment of feather and hair; reprocessing this waste as feed supplementation of protein with high nutritious value and high digestible ability for domestic animal; making friendly environment. Keyword: Bacillus megaterium K79, Brevibacillus parabrevis Kr110, backyard chicken, biological feather powder, feather decomposed ratio, good carcass ratio. vii MỤC LỤC Trang LỜI ÁM ƠN ........................................................................................................ ii TÓM LƢỢ ........................................................................................................ iii ABSTRACT ........................................................................................................... v DANH SÁCH HÌNH ........................................................................................... xii ANH SÁ H ẢNG ........................................................................................ xiv ANH MỤ TỪ VIẾT TẮT ............................................................................. xix hƣơng 1 GI I THI U ........................................................................................ 1 1.1 Lý do chọn đề tài, lĩnh vực nghiên cứu ............................................................ 1 1.2 Mục tiêu của đề tài ........................................................................................... 2 1.3 Nội dung nghiên cứu ........................................................................................ 3 1 4 Những đóng góp mới của đề tài ........................................................................ 3 CHƢƠNG 2 TỔNG QUAN T I LI U ................................................................. 5 2.1 Sơ lƣợc về chất thải lông .................................................................................. 5 2.2 Sơ lƣợc về keratin ............................................................................................. 6 2.3 ác phƣơng pháp ph n giải keratin .................................................................. 7 2.3.1 Phƣơng pháp lý hóa ...................................................................................... 7 2.3.2 Phƣơng pháp sinh học .................................................................................... 8 2.4 Keratinase ......................................................................................................... 8 2 5 ơ chế ph n giải keratin của vi khuẩn ............................................................ 12 2.6 Vi khuẩn ph n giải keratin .............................................................................. 13 2.6.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới .............................................................. 13 2 6 2 Tình hình nghiên cứu trong nƣớc ................................................................ 18 2.7 ác yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng ph n giải keratin, sự tạo keratinase và mật số của vi khuẩn ph n giải keratin ....................... 18 2 7 1 Ảnh hƣởng của chất dinh dƣ ng trong môi trƣờng nuôi cấy ...................... 19 2 7 2 Ảnh hƣởng của nhiệt độ và pH .................................................................... 22 viii 2.7.3 Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy .............................................................. 24 2.8 Nhu cầu dinh dƣ ng của gia cầm ................................................................ 25 2.8.1 Nhu cầu về protein ...................................................................................... 25 2.8.2 Nhu cầu về năng lƣợng ............................................................................... 27 2.8.3 Nhu cầu về chất xơ ..................................................................................... 27 2.8.4 Ảnh hƣởng của các khẩu phần protein lên năng suất sinh trƣởng và chất lƣợng th n th t của gà ................................................... 28 2.9 ột lông gia cầm (bột lông vũ) ..................................................................... 29 HƢƠNG 3 VẬT LI U V PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN ỨU ....................... 33 3.1 Sơ đồ khối tổng quát nội dung luận án ........................................................... 33 3.2 Nội dung 1: Khảo sát thực trạng chất thải lông ở các cơ sở giết mổ gia súc gia cầm tại thành phố ần Thơ, Vĩnh Long và Đồng Tháp .......................... 34 3 3 Nội dung 2: Ph n lập, tuyển chọn và nhận diện vi khuẩn hiếu khí ph n giải keratin mạnh từ chất thải chăn nuôi và chế biến gia súc, gia cầm ............... .34 3.3.1.Vật liệu ......................................................................................................... 34 3.3 2 Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................. 37 3.3 3 Ph n tích thống kê ở nội dung nghiên cứu 2 .............................................. 45 3.4 Nội dung 3 Ảnh hƣởng của các điều kiện môi trƣờng nuôi cấy đến sự phát triển, khả năng ph n hủy lông và hàm lƣợng protein của chủng sàng đƣợc tuyển từ Thí nghiệm 1 và Thí nghiệm 2 . ....................................................... 45 3.4 1 Vật liệu ......................................................................................................... 45 3.4 2 Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................. 45 3.4.3 Ph n tích thống kê ở nội dung nghiên cứu 3 .............................................. 49 3.5 Ủ lông gia cầm với chủng vi khuẩn Bacillus megaterium K79 ..................... 49 3 6 Nội dung 4: Nghiên cứu ứng dụng chủng vi khuẩn ph n hủy mạnh lông gia cầm đƣợc tuyển chọn để chế biến lông gà thành thức ăn bổ sung protein cho gà th t ............................................................... 51 3.6 1 Vật liệu thí nghiệm ..................................................................................... 51 3.6 2 Phƣơng pháp thí nghiệm ............................................................................. 55 3.6 3 ác ch tiêu theo d i .................................................................................... 56 3.6 4 Ph n tích hóa học ......................................................................................... 59 ix 3.6.5 Ph n tích thống kê nội dung 4 .................................................................. 60 HƢƠNG 4 KẾT QUẢ V THẢO LUẬN....................................................... 61 4.1 Nội dung 1: Khảo sát hiện trạng chất thải lông gia súc, gia cầm tại Thành phố ần Thơ, Vĩnh Long và Đồng Tháp ....................................................... 61 4.1.1 Kết quả khảo sát ........................................................................................... 61 4 1 2 ách xử lý chất thải lông ở các cơ sở giết mổ ............................................. 63 4.2 Nội dung 2: Ph n lập, tuyển chọn và nhận diện vi khuẩn hiếu khí ph n giải keratin mạnh từ chất thải chăn nuôi và chế biến gia súc, gia cầm ....................................................... 64 4 2 1 Kết quả ph n lập, tuyển chọn và nhận diện một số chủng vi khuẩn có khả năng ph n giải keratin của lông gia cầm từ chất thải chăn nuôi và chế biến gia cầm .......................... 64 4 2 2 Kết quả ph n lập, tuyển chọn và nhận diện một số chủng vi khuẩn có khả năng ph n giải keratin của lông gia súc từ chất thải chăn nuôi và chế biến gia súc........................................................ 70 4 2 3 Kết quả ph n lập một số chủng vi khuẩn ch u nhiệt có khả năng ph n giải keratin .......................................................................... 77 4.2.4 Kết quả đ nh danh các chủng vi khuẩn ph n giải keratin mạnh .................. 84 4 2 5 y phát sinh loài và mối tƣơng quan trình tự 16S rRNA của vi khuẩn ph n giải keratin ........................................................................... 91 4 3 Nội dung 3: Kết quả ảnh hƣởng của các điều kiện môi trƣờng nuôi cấy đến sự phát triển và khả năng ph n giải keratin của một số chủng vi khuẩn ................................................................ 95 4 3 1 Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ và pH đến sự phát triển và khả năng ph n hủy lông của 2 chủng vi khuẩn ph n giải keratin mạnh nhất ......................................................... 95 4 3 2 Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ d ch vi khuẩn đƣa vào đến sự phát triển và khả năng ph n hủy lông của chủng vi khuẩn Bacillus megaterium K79 và chủng vi khuẩn Brevibacillus parabrevis Kr110 .............................................................. 103 4.3.3 Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nguồn dinh dƣ ng chứa carbon đến sự phát triển và khả năng ph n hủy lông của chủng vi khuẩn Bacillus megaterium K79 và chủng vi khuẩn Brevibacillus parabrevis Kr110 .............................................................. 106 x 4.3.4 Ảnh hƣởng của nguồn dinh dƣ ng chứa nitơ đến sự phát triển, khả năng ph n hủy lông gia súc và hàm lƣợng protein hòa tan của chủng vi khuẩn Bacillus megaterium K79 và chủng vi khuẩn Brevibacillus parabrevis Kr110 ............................................................... 110 4 3 5 Ảnh hƣởng của thời gian đến sự ph n hủy sợi lông nguyên của