Luận văn Bước đầu tạo cây tiêu (piper nigrum) in vitro kháng nấm phytophthora sp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  ĐINH VŨ THẮNG BƢỚC ĐẦU TẠO CÂY TIÊU (Piper nigrum) IN VITRO KHÁNG NẤM Phytophthora sp. LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh 2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  BƢỚC ĐẦU TẠO CÂY TIÊU (Piper nigrum) IN VITRO KHÁNG NẤM Phytophthora sp. Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: ThS. NGUYỄN THỊ KIM LINH ĐINH VŨ THẮNG TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN NIÊN KHÓA: 2002-2006 Thành phố Hồ Chí Minh 2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY,HCHC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY  INITIAL RESEACH CREATE PEPPER (Piper nigrum) IN VITRO RESISTANTTO Phytophthora sp. GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Professor Student MSc. NGUYEN THI KIM LINH DINH VU THANG Dr. LE ĐINH ĐON TERM: 2002 - 2006 HCMC, 09/2006 i LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn: - Ban Giám Hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập. - Các thầy cô trong Bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng các thầy cô đã trực tiếp giảng dạy trong suốt bốn năm qua. - Thầy Lê Đình Đôn và cô Nguyễn Thị Kim Linh đã tận tình hƣớng dẫn và động viên trong thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp. - Các anh chị phụ trách phòng 118 và 105 Khu Phƣợng Vỹ thuộc Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật - Đại học Nông Lâm TP. HCM. - Thầy Trần Ngọc Hùng cùng các chị thuộc Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Đại học Nông Lâm TP. HCM. - Tập thể lớp CNSH28, hai bạn Nhã Trầm và Thanh Huyền lớp CNSH29 đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian học tập và làm đề tài. Thành kính ghi ơn ba mẹ cùng những ngƣời thân trong gia đình luôn tạo điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập tại trƣờng. TP. Hồ Chí Minh tháng 08 năm 2006 Đinh Vũ Thắng ii TÓM TẮT ĐINH VŨ THẮNG, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2006. “BƢỚC ĐẦU TẠO CÂY TIÊU (Piper nigrum) IN VITRO KHÁNG NẤM Phytophthora sp.” Giáo viên hƣớng dẫn: TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN ThS. NGUYỄN THỊ KIM LINH Đề tài “Bƣớc đầu tạo cây tiêu (Piper nigrum) in vitro kháng nấm Phytophthora sp.” đƣợc tiến hành giai đọan đầu là giai đoạn tạo ra cây tiêu trong phòng thí nghiệm tại Bộ môn Công Nghệ Sinh Học và Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật – Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh từ tháng 2 đến tháng 6 năm 2006. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của dịch chiết nấm Phytophthora đến khả năng hình thành chồi từ mô sẹo tiêu  Tạo mô sẹo từ mẫu lá cây tiêu in vitro Thí nghiệm đƣợc thực hiện trên môi trƣờng MS có bổ sung 1mg/L 2,4D và 3mg/L BA.  Nuôi cấy tạo dịch nấm Phytophthora  Thí nghiệm chủng dịch nấm Phytophthora trong môi trƣờng nuôi cấy mô sẹo cây tiêu Thực hiện chủng dịch nấm Phytophthora vào môi trƣờng nuôi cấy mô sẹo tiêu với nhiều nồng độ dịch nấm khác nhau. (bảng bố trí thí nghiệm). Thí nghiệm 2: Nhuộm mẩu mô sẹo Nhuộm mẫu bằng phẩm nhuộm hai màu là dung dịch gồm hai thứ phẩm nhuộm: - Phẩm đỏ Carmin sẽ nhuộm màu hồng lạt hay tím lạt nếu màng tế bào bằng chất cellulose pectic. - Phẩm xanh lục vert d’iod sẽ nhuộm màu xanh lục nếu màng tế bào bằng chất gỗ (ligin) hay bần (suberin). iii Bố trí thí nghiệm chủng dịch nấm Phytophthora trong môi trƣờng nuôi cấy mô sẹo cây tiêu Phƣơng pháp vô trùng Nghiệm thức Nồng độ dịch nấm (%) Số chai Số mẫu/chai Tổng số mẫu DC 0 15 2 30 Hấp khử trùng CC 5 15 2 30 CB 10 15 2 30 CA 20 15 2 30 Lọc vô trùng KC 5 15 2 30 KB 10 15 2 30 KA 20 15 2 30 Ghi chú: DC: đối chứng có nồng độ dịch nấm là 0%, CC: nồng độ dịch nấm 5% có hấp khử trùng, CB: nồng độ dịch nấm 10% có hấp khử trùng, CA: nồng độ dịch nấm 20% có hấp khử trùng, KC: nồng độ dịch nấm 5% lọc vô trùng, KB: nồng độ dịch nấm 10% lọc vô trùng, KA: nồng độ dịch nấm 20% lọc vô trùng. iv MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................. i TÓM TẮT ................................................................................................................... ii MỤC LỤC ................................................................................................................. iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ....................................................................... vii DANH SÁCH CÁC BẢNG .................................................................................... viii DANH SÁCH CÁC HÌNH ..................................................................................................... ix PHẦN 1. GIỚI THIỆU ............................................................................................... 1 1.1 Đặt vấn đề ............................................................................................................. 1 1.2 Mục đích ............................................................................................................... 2 1.3 Yêu cầu ................................................................................................................. 2 1.4 Giới hạn đề tài ....................................................................................................... 2 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................... 3 2.1 Nguồn gốc và lịch sử phát triển cây tiêu .............................................................. 3 2.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ hạt tiêu trên thế giới và Việt Nam ....................... 3 2.2.1 Thế giới ........................................................................................................ 3 2.2.2 Việt Nam ...................................................................................................... 4 2.2.2.1 Tình hình sản xuất ............................................................................... 4 2.2.2.2 Tình hình tiêu thụ ................................................................................ 7 2.3 Tình hình bệnh trên cây tiêu ................................................................................. 8 2.3.1 Bệnh chết nhanh dây tiêu do nấm Phytophothra gây ra .............................. 8 2.3.2 Điều kiện phát sinh bệnh, phát triển bệnh .................................................... 9 2.4 Giới thiệu về giống Phytophthora ........................................................................ 9 2.5 Lịch sử phát triển của nuôi cấy mô tế bào thực vật ............................................ 10 2.6 Sự hình thành và phát triển của mô sẹo .............................................................. 15 2.6.1 Sự hình thành mô sẹo ................................................................................. 15 2.6.2 Sự hình thành chồi từ mô sẹo ..................................................................... 17 2.7 Các nhóm chất kích thích ảnh hƣởng lên quá trình tạo mô sẹo ......................... 17 v 2.7.1 Auxin .......................................................................................................... 17 2.7.1.1 Tính chất sinh lý của Auxin ............................................................. 18 2.7.1.2 Auxin trong cây trồng ........................................................................ 18 2.7.1.3 Các chất auxin tổng hợp .................................................................... 19 2.7.2 Cytokinine .................................................................................................. 19 2.7.2.1 Tính chất sinh lý của Cytokinine ....................................................... 20 2.7.2.2 Cytokinine trong cây trồng ................................................................ 20 2.8 Một số nghiên cứu tạo cây kháng bệnh bằng phƣơng pháp nuôi cấy in vitro .......................................................... 20 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ............................................................ 22 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ...................................................................... 22 3.2 Thiết bị và dụng cụ phòng thí nghiệm ................................................................ 22 3.2.1 Phòng chuẩn bị môi trƣờng ....................................................................... 22 3.2.2 Phòng cấy cây ............................................................................................ 22 3.2.3 Phòng cấy nấm ........................................................................................... 22 3.2.4 Phòng nuôi cây ........................................................................................... 23 3.2.5 Môi trƣờng cơ bản dùng trong thí nghiệm ................................................. 23 3.3. Vật liệu nuôi cấy ................................................................................................ 23 3.4. Phƣơng pháp thí nghiệm .................................................................................... 24 3.4.1 Thí nghiệm : Ảnh hƣởng của dịch chiết nấm Phytophthora đến khả năng hình thành chồi từ mô sẹo tiêu ................. 24 3.4.1.1 Tạo mô sẹo từ mẫu lá cây tiêu in vitro .............................................. 24 3.4.1.2 Nuôi cấy tạo dịch nấm Phytophthora ................................................ 24 3.4.2.3 Thí nghiệm chủng dịch nấm Phytophthora trong môi trƣờng nuôi cấy mô sẹo cây tiêu ............................................. 25 3.4.4 Nhuộm mẫu mô sẹo và xem kết quả dƣới kính hiển vi ................................... 27 3.5 Phân tích thống kê .............................................................................................. 27 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................. 28 4.1 Thí nghiệm : Ảnh hƣởng của dịch chiết nấm Phytophthora đến khả nằng hình thành chồi từ mô sẹo tiêu .............................. 28 4.1.1 Tạo mô sẹo từ mẫu lá cây tiêu in vitro ....................................................... 28 vi 4.1.2 Thí nghiệm chủng dịch nấm Phytophthora trong môi trƣờng nuôi cấy mô sẹo cây tiêu ......................................................... 28 4.3 Nhuộm mẫu mô sẹo tiêu sau 10 tuần nuôi cấy ................................................... 34 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................. 37 5.1 Kết luận ............................................................................................................... 37 5.2 Kiến nghị ............................................................................................................ 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 38 MỤC LỤC 1 ............................................................................................................. 39 MỤC LỤC 2 ............................................................................................................. 40 vii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT HSTTMS: Hệ số tăng trƣởng mô sẹo BA: Benzyladenine 2,4-D: 2,4 – Dichlorophenoxyacetic Acid MS: Murashige & Skoog ctv: Cộng tác viên viii DANH SÁCH CÁC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 2.1 Sản lƣợng tiêu của những quốc gia sản xuất tiêu từ 1991-1996 ....................... 5 Bảng 2.2 Tình hình sản xuất hồ tiêu các tỉnh trọng điểm (1997 - 1999) .................... 6 Bảng 2.3 Tình hình sản xuất - xuất khẩu hạt tiêu của Việt Nam và thƣơng mại quốc tế .................................................................. 7 Bảng 2.4 Thị trƣờng và số lƣợng hạt tiêu xuất khẩu từ 1996 – 6 tháng đầu năm 2000 (Tại cảng Sài Gòn - Thành phố Hồ Chí Minh) ................ 7 Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm chủng dịch nấm Phytophthora trong môi trƣờng nuôi cấy mô sẹo cây tiêu ................................. 26 Bảng 4.1 Kết quả tái sinh chồi và hệ số tăng trƣởng mô sẹo sau 90 ngày cấy .................................................... 29 ix DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình 4.1 Sự hình thành mô sẹo từ lá cây tiêu trên môi trƣờng MS có bổ sung 1mg/L 2,4D và 3mg/L BA .................................................................................. 28 Hình 4.2: Chồi tiêu hình thành từ mô sẹo trên môi trƣờng MS có bổ sung 1mg/L 2,4-D và 3mg/L BA sau 90 ngày nuôi cấy .............................................. 31 Hình 4.3 Chồi tiêu hình thành từ mô sẹo trên môi trƣờng MS có bổ sung 1mg/L 2,4-D, 3mg/L BA và 5% dịch nấm, hấp khử trùng sau 90 ngày nuôi cấy .......... 31 Hình 4.4 Chồi tiêu hình thành từ mô sẹo trên môi trƣờng MS có bổ sung 1mg/L 2,4-D, 3mg/L BA và 10% dịch nấm, hấp khử trùng sau 90 ngày nuôi cấy ........ 32 Hình 4.5 Chồi tiêu hình thành từ mô sẹo trên môi trƣờng MS có bổ sung 1mg/L 2,4-D, 3mg/L BA và 20% dịch nấm, hấp khử trùng sau 90 ngày nuôi cấy ....... 32 Hình 4.6 Chồi tiêu hình thành từ mô sẹo trên môi trƣờng MS có bổ sung 1mg/L 2,4-D, 3mg/L BA và 5% dịch nấm, lọc vô trùng sau 90 ngày nuôi cấy ............. 33 Hình 4.7 Chồi tiêu hình thành từ mô sẹo trên môi trƣờng MS có bổ sung 1mg/L 2,4-D, 3mg/L BA và 10% dịch nấm, lọc vô trùng sau 90 ngày nuôi cấy ........... 33 Hình 4.8 Chồi tiêu hình thành từ mô sẹo trên môi trƣờng MS có bổ sung 1mg/L 2,4-D, 3mg/L BA và 20% dịch nấm, lọc vô trùng sau 90 ngày nuôi cấy ........... 34 Hình 4.9 Mặt cắt mặt dƣới mô sẹo cây tiêu nuôi cấy trên môi trƣờng MS có bổ sung 1mg/L2,4D, 3mg/L BA sau 10 tuần (độ phóng đại 4x10) .................... 35 Hình 4.10 Mặt cắt mặt dƣới mô sẹo cây tiêu nuôi cấy trên môi trƣờng MS có bổ sung 1mg/L2,4D, 3mg/L BA và 10% dịch nấm sau 10 tuần (độ phóng đại 4x10) ............................................................................................ 35 1 PHẦN 1. GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Cây hồ tiêu (Piper nigum L. ) là loại cây công nghiệp có giá trị kinh tế cao, nó mang lại nguồn thu nhập chính cho nhiều hộ gia đình ở nƣớc ta. Hạt tiêu là một loại gia vị đƣợc ƣa chuộng trên khắp thế giới. Hạt tiêu có vị cay, có mùi thơm là gia vị không thể thiếu của nhiều món ăn. Ngoài ra tiêu còn đƣợc dùng trong công nghiệp chế biến hƣơng liệu, nƣớc hoa và trong y dƣợc. Việt Nam là một nƣớc có điều kiện khí hậu rất thuận lợi cho việc trồng và phát triển cây hồ tiêu. Trong những năm gần đây diện tích trồng tiêu của nƣớc ta đã gia tăng rất nhanh nhất là vùng miền Đông Nam Bộ và Tây Nguyên. Cùng với việc gia tăng về diện tích là việc gia tăng về sản lƣợng xuất khẩu. Do đó, áp lực dịch bệnh ngày càng gia tăng trong các vƣờn tiêu. Trong đó bệnh chết nhanh dây tiêu do nấm Phytophthora gây ra thực sự là một tai họa cho nhà vƣờn ở các vùng tiêu nguyên liệu lớn ở nƣớc ta. Bệnh xuất hiện và lây lan rất nhanh, thƣờng làm tiêu chết hạng loạt, thiệt hại năng suất trầm trọng, vì vậy việc hạn chế thiệt hại do loại bệnh này gây ra là một yêu cầu cấp thiết hiện nay. Hiện nay trên thế giới chƣa có một dòng tiêu thƣơng mại nào có khả năng kháng với nấm Phytophthora. Tuy nhiên, một vài dòng tiêu có khả năng chống chịu với loại nấm này đã đƣợc tìm thấy ở Ấn Độ, Malaysia và Indonesia. Ở Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu về các biện pháp phòng trừ loại nấm này nhƣng chƣa có biện pháp nào thực sự có hiệu quả và lâu dài. Ngƣời dân chủ yếu sử dụng thuốc hóa học làm biện pháp chính để hạn chế bệnh nhƣng không có hiệu quả. Sử dụng thuốc hóa học rất tốn kém và dẫn đến các tác hại đối với môi trƣờng. Các nghiên cứu về biện pháp sử dụng nấm đối kháng vẫn chƣa thực sự có hiệu quả. Vì vậy cần phải có những dòng tiêu có khả năng chống chịu với nấm Phytophthora để làm giảm thiệt hại do loại nấm này gây ra. Trƣớc những yêu cầu cấp thiết đó chúng tôi quyết định thực hiện đề tài “Tạo cây tiêu (Piper nigrum) in vitro kháng nấm Phytophthora sp.” để tạo ra những dòng tiêu có khả năng chống chịu với nấm Phytophthora nhằm làm giảm thiệt hại của loài nấm này gây ra. 2 1.2 Mục đích - Tạo cây tiêu có khả năng chống chịu nấm Phytophthora. 1.3 Yêu cầu - Thực hiện chủng dịch nấm Phytophthora vô trùng với nhiều nồng độ khác nhau trên mô sẹo tiêu. - Bƣớc đầu tạo ra nhiều cá thể sau đó thực hiện việc chọn lọc các cá thể có tính kháng cao. - Thực hiện nhuộm mẫu mô sẹo tiêu, xem hình thái để bƣớc đầu đánh giá ảnh hƣởng của dịch nấm đối với sự phát triển của mô sẹo. 1.4 Giới hạn đề tài Do giới hạn về thời gian nên đề tài chỉ dừng lại ở giai đoạn tạo ra cây tiêu in vitro trong phòng thí nghiệm. 3 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Nguồn gốc và lịch sử phát triển cây tiêu Cây tiêu (Piper nigrum) thuộc họ Piperaceae. Có nguồn gốc từ tây nam Ấn Độ nằm ở vùng Ghats và Assam, mọc hoang trong rừng, đƣợc ngƣời Ấn Độ phát hiện, sử dụng đầu tiên và cho rằng việc phát hiện này là rất quý giá. Đến đầu thế kỷ thứ XIII cây tiêu mới đƣợc trồng rộng rãi và sử dụng trong bữa ăn hàng ngày. Lúc này, cây tiêu đã đƣợc trồng cả ở Indonesia và Malaysia. Đến thế kỷ thứ XVIII cây tiêu đƣợc trồng ở Srilanka và Campuchia. Vào đầu thế kỷ thứ XX thì cây tiêu đƣợc trồng tiếp ở các nƣớc nhiệt đới nhƣ Châu Phi nhƣ: Madagasca, Nigieria, Congo và ở châu Mỹ nhƣ: Brazil, Mexico… Ở nƣớc ta cây tiêu đƣợc trồng rất lâu từ trƣớc khi ngƣời Pháp đến xâm chiếm. Khi những ngƣời Trung Hoa di dân vào Campuchia ở dọc vùng biển vịnh Thái Lan nhƣ: Konpong Trach, Kep, Campot và lúc đó tiêu đƣợc trồng ở nƣớc ta chủ yếu ở đảo Phú Quốc, Hòn Chông, Hà Tiên, một số ít ở Bà Rịa và Thủ Dầu Một. 2.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ hạt tiêu trên thế giới và Việt Nam 2.2.1 Thế giới Theo thống kê của FAO thì hiện nay trên thế giới có khoảng 70 nƣớc trồng tiêu. 1954 toàn thế giới có khoảng 64.000 tấn hột tiêu. 1978 là 160.000 tấn hột tiêu. 1983 là 180.000 tấn hột tiêu. Sau 1982 sản lƣợng tiêu trên thế giới giảm dần do sâu bệnh và thời tiết. Đồng thời một phần cũng do sự ô nhiễm môi trƣờng gây ảnh hƣởng tới sự thụ phấn của hoa tiêu. Đến năm 1989-1990 diện tích trồng tiêu trên toàn thế giới đã tăng vọt và sản lƣợng đạt khoảng 185.000 tấn tiêu hột. Các nƣớc sản xuất tiêu nhiều nhất trên thế giới lúc này là Ấn Độ, Indonesia, Malaysia, Brazil, Madagasca và Srilanka. Hiện nay, những nƣớc trồng tiêu nhiều nhất là Ấn Độ, Indonesia và Việt Nam. Trên thế giới mức tiêu thụ hạt tiêu hàng năm đạt khoảng 4-5%. Các sản phẩm đƣợc trao đổi dƣới dạng: tiêu đen, tiêu trắng, tiêu xanh và dầu nhựa tiêu. Hiện nay, nƣớc Mỹ đang đứng đầu về nhập khẩu tiêu với khoảng 1/3 lƣợng tiêu của thế giới. Sau 4 đó là các nƣớc Nga, Đức, Pháp, Ý và thị trƣờng của Anh. Ngoài ra thị trƣờng các nƣớc Trung Đông và Bắc Phi cũng đang tiêu thụ ngày càng nhiều. (Bảng 2.1) 2.2.2 Việt Nam 2.2.2.1 Tình hình sản xuất Trƣớc năm 1975, Miền Bắc đƣợc trồng chủ yếu ở Nghệ An, Quảng Bình và Miền Nam đƣợc trồng ở Phú Quốc, Long Khánh, Lộc Ninh. Năm 1995 diện tích từng bƣớc gia tăng song biến động không ổn định bởi thiên tai, bệnh tật. Từ 1990- 1995 do giá tiêu bị giảm mạnh và không có thị trƣờng tiêu thụ nên các vƣờn tiêu bị phá đi rất nhiều. Từ năm 1996 các nƣớc nhƣ Indonesia, Brazil,… bị ảnh hƣởng của thiên tai, khu vực Đông Nam Á bị khủng hoảng tài chính, nên giá tiêu đã gia tăng lên 4.000 USD/tấn vào năm 2000, và đó là cơ hội thuận lợi cho hồ tiêu Việt Nam vƣơn lên chiếm lĩnh thị trƣờng hạt tiêu thế giới. Năm 1997-1999 diện tích tiêu tăng từ 9.777 lên 15.461 ha. Diện tích tiêu tăng nhanh nhất ở vùng Đông Nam Bộ từ 5.893 ha tăng lên 9.115 ha (chiếm 60,27% diện tích tiêu của cả nƣớc). (Bảng 2.2) Năng suất tăng chậm và có sự sai khác rất lớn giữa các vùng và tỉnh có trồng tiêu. Năng suất bình quân năm 1997 là 2,08 tấn/ha đến năm 1999 cũng chỉ đạt 2,12 tấn/ha nhƣng cao nhất là ở vùng Đông Nam Bộ đạt 2,55 tấn/ha, trong khi năng suất thấp nhất là ở vùng Bắc Trung Bộ chỉ đạt 0,75 tấn/ha (bằng 29,4% so với n