Luận văn Chọn hỗn hợp vi khuẩn bacillus đối kháng vibrio

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN NGUYỄN THỊ NGỌC HUYỀN CHỌN HỖN HỢP VI KHUẨN Bacillus ĐỐI KHÁNG Vibrio LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2012 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN NGUYỄN THỊ NGỌC HUYỀN CHỌN HỖN HỢP VI KHUẨN Bacillus ĐỐI KHÁNG Vibrio LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN TS. PHẠM THỊ TUYẾT NGÂN 2012 i LỜI CẢM TẠ Đầu tiên tôi xin chân thành gởi lời tri ân đến các quý Thầy cô khoa Thủy sản trường Đại học Cần Thơ, đã truyền đạt những kiến thức quý báo trong suốt quá trình học và nghiên cứu tại trường. Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Phạm Thị Tuyết Ngân đã tận tình hướng dẫn cũng như luôn tạo mọi điều kiện thuận lợi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận văn tốt nghiệp này. Đồng thời xin gởi lời cảm ơn đến cô cố vấn học tập Trần Thị Tuyết Hoa, cùng với Thầy cô và các anh chị bộ môn Thủy sinh học ứng dụng đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Và tôi cũng xin chân thành biết ơn sâu sắc gia đình và những người thân đã tạo mọi điều kiện, tình yêu thương, sự động viên về vật chất cũng như tinh thần trong suốt thời gian học và hoàn thành luận văn. Gửi lời cảm tạ đến tập thể lớp BHTS – K35 đã hết lòng ủng hộ, quan tâm, giúp đỡ trong suốt thời gian qua. Chân thành cảm ơn! ii TÓM TẮT Đề tài được thực hiện nhằm chọn lọc các hỗn hợp vi khuẩn Bacillus có khả năng đối kháng nhóm Vibrio gây bệnh. Vi khuẩn khảo sát gồm 9 dòng Bacillus: B2, B7, B8, B9, B17 B37, B38, B41, B67 có nguồn gốc từ ao nuôi tôm sú thâm canh ở tỉnh Sóc Trăng, có khả năng cải thiện chất lượng nước và nâng cao tỉ lệ sống của tôm. Phương pháp đục lỗ thạch được áp dụng để kiểm tra đặc tính tương thích giữa các dòng vi khuẩn Bacillus, những dòng vi khuẩn không đối kháng lẫn nhau đã được kết hợp lại tạo hỗn hơp. Tượng tự đối với thí nghiệm kiểm tra khả năng đối kháng nhóm Vibrio của các dòng/hỗn hợp Bacilus tìm được với chỉ tiêu đánh giá là đường kính vòng vô khuẩn xung quanh các lỗ thạch. Kết quả tìm được 9 hỗn hợp trong 4 nhóm vi khuẩn sau đây thể hiện sự tương thích lẫn nhau: (B2, B7, B41), (B2, B8, B41), (B9, B41), (B8, B67). Kết quả khảo sát cho thấy có 5 trong tổng số 9 dòng vi khuẩn Bacillus (B2, B8, B9, B41, B67) có khả năng đối kháng vi khuẩn Vibrio. Có 6 hỗn hợp được tuyển chọn H2 (B2, B8, B41), H4 (B2, B8), H5 (B2, B41), H7 (B8, B41), H8 (B9, B41), H9 (B8, B67) dựa trên hai tiêu chí đặc tính tương thích giữa các dòng vi khuẩn Bacillus và khả năng đối kháng Vibrio. Tất cả 6 hỗn hợp được chọn lọc đều thể hiện đặc tính đối kháng Vibrio, tuy nhiên ở các mức độ khác nhau. Trong đó khả năng kháng Vibrio harveyi 30953 mạnh nhất là các hỗn hợp H7 (0,56 cm), H2 (0,70 cm); đối với Vibrio harveyi 0986 có H9 (0,67 cm), H2 (0,57 cm), H5 (0,48 cm) có kích thước đường kính vòng vô khuẩn cao. Riêng chủng Vibrio V(x) có nguồn gốc từ trại thực nghiệm khoa Thủy sản, trường Đại học Cần Thơ cho kết quả hai hỗn hợp H5 (0,73 cm) và H9 (0,60 cm) có khả năng đối kháng vượt trội hơn hẳn các hỗn hợp còn lại. iii MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ ........................................................................................................................... i TÓM TẮT ................................................................................................................................ ii MỤC LỤC .............................................................................................................................. iii DANH SÁCH BẢNG ............................................................................................................ iv DANH SÁCH HÌNH.............................................................................................................. iv DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT............................................................................................... iv Phần 1: GIỚI THIỆU .............................................................................................................. 1 1.1 Giới thiệu ..................................................................................................................... 1 1.2 Mục tiêu đề tài:............................................................................................................ 1 1.3 Nội dung đề tài:........................................................................................................... 2 1.4 Thời gian thực hiện đề tài:.......................................................................................... 2 Phần 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ......................................................................................... 3 2.1 Đặc điểm và vai trò của nhóm vi khuẩn Bacillus........................................................ 3 2.1.1 Đặc điểm sinh học ................................................................................................. 3 2.1.2 Vai trò ..................................................................................................................... 3 2.2 Tình hình nghiên cứu bệnh do Vibrio gây ra trên động vật thủy sản ........................ 6 2.3 Một giải pháp mới thay thế kháng sinh - Probiotic..................................................... 8 2.4 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Bacillus ứng dụng trong thủy sản ............................ 9 Phần 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................... 12 3.1 Vật liệu nghiên cứu .................................................................................................... 12 3.1.1 Thiết bị và dụng cụ .............................................................................................. 12 3.1.1 Nguồn vi khuẩn.................................................................................................... 12 3.1.3 Môi trường nuôi.................................................................................................. 12 3.1.1 Hóa chất................................................................................................................ 13 3.2 Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................... 13 3.2.1 Khảo sát đặc tính tương thích giữa các dòng Bacillus chọn lọc ...................... 13 3.3.2 Khảo sát khả năng đối kháng Vibrio gây bệnh của các dòng vi khuẩn Bacillus chọn lọc.......................................................................................................................... 16 3.3.3 Khảo sát khả năng đối kháng Vibrio gây bệnh của các hỗn hợp Bacillus ....... 18 3.3.3 Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn ............................................................ 20 3.4 Phương pháp xử lí số liệu ........................................................................................... 20 4.1 Kết quả khảo sát đặc tính tương thích giữa các dòng Bacillus chọn lọc........... 22 4.2 Kết quả khảo sát khả năng đối kháng Vibrio của các dòng Bacillus................. 23 4.3 Kết quả khảo sát khả năng đối kháng Vibrio của các hỗn hợp Bacillus. .......... 24 Phần 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT.................................................................................... 30 5.1 Kết luận........................................................................................................................ 30 5.2 Đề xuất......................................................................................................................... 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................................... 32 PHỤ LỤC............................................................................................................................... 35 iv DANH SÁCH BẢNG Bảng 4.1: Đặc tính tương thích của 9 dòng vi khuẩn Bacillus chọn lọc............................ 22 Bảng 4.2: Đường kính vòng vô khuẩn (cm) của Vibrio đối kháng các dòng vi khuẩn Bacillus................................................................................................................................... 23 Bảng 4.3: Đường kính vòng vô khuẩn (cm) của Vibrio đối kháng các hỗn hợp vi khuẩn Bacillus................................................................................................................................... 25 DANH SÁCH HÌNH Hình 3.1: Phục hồi và nuôi tăng sinh vi khuẩn trong môi trường TSB ............................. 14 Hình 3.2: Sơ đồ xác định đặc tính tương thích bằng phương pháp đục lỗ thạch ............. 15 Hình 3.3: Sơ đồ xác định hoạt tính kháng khuẩn của từng dòng vi khuẩn riêng lẻ bằng phương pháp đục lỗ thạch ........................................................................................ 17 Hình 3.4: Sơ đồ xác định hoạt tính kháng khuẩn của hỗn hợp vi khuẩn bằng phương pháp đục lỗ thạch ............................................................................................................... 19 Hình 3.5: Dụng cụ và qui trình đục lỗ thạch........................................................................ 21 Hình 4.1: Đường kính vòng kháng khuẩn............................................................................ 26 Hình 4.2: Phân lập vi khuẩn trên môi trường TCBS ........................................................... 28 Hình 4.3: Dịch khuẩn sau khi ly tâm.................................................................................... 28 Hình 4.4: Kích thước vòng vô khuẩn ................................................................................... 29 DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT ĐBSCL: Đồng bằng sông Cửu Long CFU: Colony forming unit (đơn vị hình thành khuẩn lạc) OD: Optical Density TSB: Tryptic Soya Broth TSA: Tryptic Soya Agar TCBS: Thiosulphate citrate bile salt agar NA Nutrient Agar V. harveyi Vibrio harveyi B. subtillis Bacillus subtillis B. cereus Bacillus cereus 1 Phần 1: GIỚI THIỆU 1.1 Giới thiệu Tôm sú (Penaeus monodon) là một trong những đối tượng thủy sản có giá trị kinh tế cao ở Việt Nam, đặc biệt là vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL). Tuy nhiên tỉ lệ sống của đối tượng này thường không ổn định, việc nhiễm bệnh do vi khuẩn (chủ yếu là nhóm Vibrio) gây ảnh hưởng lớn đến năng suất nuôi. Hiện nay tình hình sử dụng kháng sinh bừa bãi trong phòng trị bệnh cho tôm nuôi đã gây hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh. Vì vậy, chế phẩm vi sinh (probiotic) đã trở thành một trong những cách tiếp cận mới thay thế cho việc sử dụng kháng sinh. Tuy nhiên phần lớn các chế phẩm vi sinh sử dụng trong nước hiện nay đều có nguồn gốc ngoại nhập hoặc không rõ thành phần, chủng loại. Các chế phẩm vi sinh phân lập và sản xuất trong nước vẫn còn hạn chế. Việc nghiên cứu chọn lựa những hỗn hợp các dòng vi khuẩn có khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh, có nguồn gốc tại địa phương làm cơ sở cho việc sản xuất đại trà chế phẩm vi sinh là một vấn đề cần thiết trong giai đoạn hiện nay. Bacillus là một trong các nhóm vi khuẩn được nghiên cứu nhiều nhất, nó có vai trò quan trọng vì khả năng sản sinh nhiều sản phẩm biến dưỡng thứ cấp như kháng sinh, thuốc trừ sâu sinh học, hóa chất và enzyme. Một số dòng vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus: B37, B41, B67,...được phân lập từ ao nuôi tôm thâm canh ở tỉnh Sóc Trăng đã được chọn lựa nghiên cứu vì tính thích nghi với điều kiện sinh thái vùng ĐBSCL. Xuất phát từ những vấn đề trên, đề tài “Chọn hỗn hợp vi khuẩn Bacillus đối kháng Vibrio” đã được thực hiện. 1.2 Mục tiêu đề tài: Xác định hỗn hợp vi khuẩn Bacillus chọn lọc có khả năng đối kháng nhóm Vibrio gây bệnh từ các dòng vi khuẩn có đặc tính tương thích lẫn nhau. 2 1.3 Nội dung đề tài: Khảo sát đặc tính tương thích (không đối kháng lẫn nhau) giữa các dòng Bacillus chọn lọc. Đánh giá khả năng đối kháng Vibrio của các dòng vi khuẩn Bacillus chọn lọc Đánh giá khả năng đối kháng Vibrio các hỗn hợp vi khuẩn đã tuyển chọn. 1.4 Thời gian thực hiện đề tài: Từ 09/2012 đến 12/2012. Tại phòng phân tích vi sinh - Bộ môn Thủy Sinh Học Ứng Dụng, Khoa Thủy Sản - Trường Đại Học Cần Thơ. 3 Phần 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Đặc điểm và vai trò của nhóm vi khuẩn Bacillus 2.1.1 Đặc điểm sinh học Bacillus là những vi khuẩn gram dương, catalase dương tính, nhóm vi khuẩn này thường tìm thấy trong môi trường có độ pH biến động cao, sinh trưởng dưới điều kiện hiếu khí hoặc kị khí không bắt buộc, sử dụng khí oxy làm chất nhận electron khi trao đổi khí trong quá trình trao đổi chất. Thuộc chi Bacillaceae, đứng riêng rẽ hoặc kết thành chuỗi hay thành sợi. Chúng có khả năng tạo ra bào tử khi xảy ra các điều kiện khắc nghiệt như thiếu chất dinh dưỡng, nhiệt độ cao,...phần lớn tế bào này có bào tử trong, hình oval có khuynh hướng phình ra ở một đầu. Bào tử có tính kháng nhiệt cao, kháng bức xạ, kháng hóa chất, kháng áp suất thẩm thấu. Khi gặp điều kiện thuận lợi có thể nảy mầm, phát triển thành tế bào sinh dưỡng. Qua kính hiển vi Bacillus đơn lẻ có hình dạng giống những chiếc que, phần lớn những chiếc que này có bào tử trong hình oval có khuynh hướng phình ra ở một đầu. Thường thì người ta quan sát thấy tập đoàn của giống sinh vật này rất rộng lớn, có hình dạng bất định và đang phát triển lan rộng. Một đặc điểm nữa của vi khuẩn Bacillus là có bao nhầy (giác mạc), bao nhầy có cấu tạo polypeptit. Việc hình thành bao nhầy giúp cho vi khuẩn B. Subtilis có khả năng chịu được các điều kiện khắc nghiệt là do bao nhầy có khả năng dự trữ thức ăn và bảo vệ vi khuẩn tránh bị tổn thương khi gặp khô hạn (Trần Thị Thu Hiền, 2010). 2.1.2 Vai trò 4 Từ rất lâu Bacillus đã được sử dụng như một chế phẩm sinh học giúp cải tiến chất lượng nước vì có một số đặc tính probiotic: + Enzym protease: Vi sinh vật tiết ra các enzym ngoại bào phân giải protein và chuyển hóa thành các phân tử có khối lượng phân tử nhỏ (các polypeptide, oligopeptid). Các chất này hoặc tiếp tục phân hủy thành các axit amin nhờ các peptidaza ngoại bào hoặc xâm nhập ngay vào tế bào rồi mới chuyển hóa thành axit amin. Một phần các axit amin này được vi sinh vật sử dụng để tổng hợp nên protein của chúng, phần khác được tiếp tục phân giải tạo thành NH3 và các sản phẩm khác. Quá trình này gọi là sự khoáng hóa hay amon hóa, đó là quá trình chuyển hóa các hợp chất hữu cơ thành dạng vô cơ (NH3). NH3 được chuyển hóa thành NO3- nhờ nhóm vi khuẩn nitrat hóa. Các hợp chất nitrat lại chuyển thành dạng nitơ phân tử nhờ các nhóm vi khuẩn khử nitrat. Các vi khuẩn tham gia vào quá trình amon hóa là Bacillus mycoides, B. subtillis, B. cereus, Pseudomonas. Aerurinosa, P. flourescens… Như vậy, vi khuẩn có khả năng tổng hợp protease mạnh là các vi khuẩn thuộc giống Bacillus và Pseudomonas. + Enzym amylase: Các amylase có nguồn gốc khác nhau thường khác nhau về tính chất, cơ chế tác dụng cũng như sản phẩm cuối. Nhiều vi sinh vật có khả năng phân giải tinh bột như vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn nhưng α-amylase chủ yếu tổng hợp từ Bacillus như Bacillus subtillis, B. licheniformis… Enzym amylase của Bacillus subtillis có khối lượng phân tử là 9. 900Da. Enzym amylase của Bacillus subtillis không đòi hỏi phải có chất hoạt hóa, pH tối ưu cho enzym amylase của Bacillus subtillis là 5,0-6,0. Enzym amylase của Bacillus subtillis được đông khô bền với canxi axetat và natri axetat. Enzym α-amylase được dùng cho giai đoạn thủy phân đầu tiên trong trao đổi chất của tinh bột. Các vi khuẩn Bacillus có khả năng sinh enzym α-amylase cao. Ngày nay việc thu enzym α-amylase và protease từ các vi khuẩn chịu mặn chịu kiềm rất được quan 5 tâm vì những ưu điểm có được từ các loại enzym thu trong việc ứng dụng: bổ sung vào thức ăn chăn nuôi, nuôi trồng thủy sản, làm nước mắm, tạo chế phẩm sinh học. + Enzym cellulase: Enzym này xúc tác sự phân hủy cellulose thành các sản phẩm trung gian là cellubiose và sản phẩm cuối cùng là glucose. Sản phẩm cuối cùng của sự thủy phân hữu cơ nhờ hệ enzym protease, amylase, cellulase là các acid amin và glucose. Đó là nguồn thức ăn cho nhiều loại vi sinh vật có ích, giúp cho chúng phát triển mạnh và làm cải thiện chất lượng nước. Bacillus tồn tại khắp nơi trong tự nhiên. Tính dễ sống, dễ tồn tại cũng là lợi thế để sử dụng Bacillus sản xuất chế phẩm sinh học. Trong quá trình hình thành bào tử, Bacillus thường sản sinh những chất có hoạt tính sinh học, ứng dụng trong nhiều lĩnh vực. Verschuere (2000) đã nghiên cứu và công bố vi khuẩn Bacillus sp đóng vai trò quan trọng trong việc cải thiện chất lượng nước do vi khuẩn này đạt hiệu quả cao trong việc chuyển đổi vật chất hữu cơ thành CO2. Do vậy, Bacillus sp làm giảm tích lũy chất hữu cơ và các chất hòa tan (trích dẫn bởi Phạm Thị Tuyết ngân, 2007). Một số loài của nhóm vi khuẩn Bacillus sp (B. Subtilis, B. Licheniformis, B. Megaterium,...) dùng để làm sạch môi trường nhờ khả năng sinh các enzyme (proteaza, amylaza, xenlulaza, kitinaza) phân hủy các hợp chất hữu cơ và kiểm soát sự phát triển quá mức của vi sinh vật gây bệnh do cơ chế cạnh tranh dinh dưỡng giữ cho môi trường luôn ở trạng thái cân bằng sinh học (Tăng Thị Chính và Đinh Thị Kim, 2006). Bacillus còn có khả năng tổng hợp chất kháng khuẩn làm giảm số lượng vi sinh vật phát triển quá mức như Vibrio, Aeromonas,.. Theo nghiên cứu của Xiang-Hong et al. (1998) thì nhóm vi khuẩn có lợi này bao gồm các cơ chế tác động như: có thể ngăn chặn sự phát triển của nhóm vi khuẩn gây bệnh hoặc sản sinh ra các chất ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh; cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự tăng trưởng của vật nuôi; cung cấp một số enyme cần thiết làm nâng cao khả năng tiêu hóa của vật nuôi; và cuối cùng là các nhóm vi khuẩn có lợi này có thể hấp thu hoặc đẩy mạnh quá trình 6 phân hủy chất hữu cơ, các chất gây độc trong môi trường nước làm cải thiện chất lượng môi trường nước. 2.2 Tình hình nghiên cứu bệnh do Vibrio gây ra trên động vật thủy sản Cùng với việc thâm canh hóa nghề nuôi tôm trong những năm gần đây, tôm nuôi của toàn thế giới đang chịu ảnh hưởng của dịch bệnh, bao gồm cả bệnh do vi khuẩn và bệnh do virus. Đa số các bệnh nhiễm khuẩn xảy ra là do tác nhân gây bệnh Vibrio spp (V. harveyi, V. splendida, V. alginolyticus, V. paraheamolyticus) và một số loài khác (Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh và ctv, 2010). Theo Đỗ Thị Hòa (2004) giống Vibrio spp thuộc họ Vibrionaceae, có một số đặc điểm chung như sau: có dạng hình que hay hình dấu phẩy, kích thước tế bào 0,3-0,5 µm x 1,4- 2,6 µm. Chúng không tạo bào tử và có khả năng di động bởi một hoặc nhiều roi. Là các vi khuẩn bắt màu gram âm, đa số phản ứng oxidase dương tính, có khả năng oxy hóa và lên men trong môi trường O/F Glucose, không có khả năng sinh H2S và mẫn cảm với (O/129). Hầu hết các giống Vibrio spp đều phân bố trong môi trường nước mặn. Môi trường Thiosulphate citrate bile salt agar (TCBS) là môi trường chọn lọc của Vibrio spp. Dựa vào màu sắc khuẩn lạc trên môi trường này, Vibrio spp được chia thành hai nhóm: nhóm có khả năng lên men đường Sucrose có khuẩn lạc màu vàng và nhóm không có khả năng lên men đường Sucrose có khuẩn lạc màu xanh lá cây trên môi trường TCBS. Nhóm vi khuẩn Vibrio là nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ hội chúng tồn tại trong môi trường nước nuôi như một thành phần của quần thể vi sinh vật tự nhiên trong ao nuôi. Khi gặp điều kiện môi trường bất lợi chúng trở thành vi khuẩn có khả năng gây bệnh. Khi bị nhiễm vi khuẩn này tôm thay đổi tập tính như bơi ven bờ hay gần mặt nước, lờ đờ, bỏ ăn, đổi màu đỏ hoặc xanh. Nếu môi trường tiếp tục xấu đi, hay số lượng vi khuẩn phát triển mạnh, tôm sẽ chết trong một thời gian ngắn hoặc bệnh sẽ chuyển thành nhiễm khuẩn mãn tính. Để ngăn ngừa bệnh này thì phải chú ý đến việc cải thiện môi trường ao nuôi. Hiện nay người ta đã phân lập và định danh được 172 chủng vi khuẩn từ tôm bệnh và tìm thấy khoảng 90% chủng