Luận văn Công nghệ tổng hợp Lysine

Luận văn Công nghệ tổng hợp Lysine ii Mục lục Danh mục hình ........................................................................................................... iv Danh mục bảng ........................................................................................................... vi Danh mục đồ thị .......................................................................................................viii CHƯƠNG I : TỔNG QUAN ....................................................................................... 1 1. 1.Giới thiệu về lysine ............................................................................................ 1 1.1.1. Khái niệm .................................................................................................... 1 1.1.2. Cấu tạo ........................................................................................................ 1 1.1.3. Vai trò và ứng dụng ..................................................................................... 2 1.1.4. Các dạng tồn tại của lysine .......................................................................... 4 1.2. Các phương pháp thu nhận lysine ...................................................................... 8 1.2.1. Phương pháp thủy phân ............................................................................... 8 1.2.2. Phương pháp tổng hợp hóa học .................................................................... 9 1.2.3. Phương pháp lên men .................................................................................. 9 1.2.4. Phương pháp kết hợp ................................................................................... 9 1.3. Cơ chế sản xuất L-lysine từ tế bào vi sinh vật .................................................. 11 1.3.1. Sơ đồ chuyển hóa ...................................................................................... 11 1.3.2. Thuyết minh các giai đoạn chuyển hóa ...................................................... 13 1.5. Tổng hợp lysine từ Corynebacterium glutamicum............................................ 19 1.5.1. Đặc điểm hình thái của Corynebacterium glutamicum ............................... 19 1.5.2. Bộ gen của Corynebacterium glutamicum ................................................. 20 1.5.3. Lịch sử sử dụng Corynebacteria glutamicum ............................................. 24 1.5.4. Sản xuất lysine theo quy mô công nghiệp .................................................. 24 1.6. Cải tạo giống Corynebacterium glutamicum .................................................... 25 1.6.1. Khái niệm .................................................................................................. 25 1.6.2. Một số phương pháp dùng để cải tạo giống Corynebacterium glutamicum 26 1.6.3 Các plasmid nội sinh của Corynebacteria glutamicum sử dụng trong việc thiết kế vector: .................................................................................................... 28 1.6.4. Việc biểu hiện gen ở Corynebacterium glutamicum ................................... 30 1.6.5. Phương pháp cải tạo giống Corynebacterium glutamicum để thu dư lysine từ aspertate .............................................................................................................. 30 1.7. Cố định tế bào vi sinh vật ................................................................................ 37 1.7.1. Định nghĩa cố định tế bào .......................................................................... 37 1.7.2. Phương pháp cố định tế bào ....................................................................... 38 1.7.3. Chất mang cố định tế bào vi sinh vật: ......................................................... 38 iii 1.7.4. Chỉ tiêu đánh giá hiệu quả cố định tế bào .................................................. 39 1.8. Công nghệ lên men L-Lysine ............................................................................ 39 1.8.1. Các vi khuẩn lên men L-lysine .................................................................. 39 1.8.2. Môi trường lên men ................................................................................... 40 1.8.3. Các phương pháp lên men ......................................................................... 44 1.8.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men ............................................. 46 1.8.5. Qui trình lên men ....................................................................................... 48 1.8.6. Thu nhận và tinh sạch sản phẩm ................................................................ 55 1.8.7. Phân tích chất lượng và số lượng L-lysine ................................................ 57 CHƯƠNG 2: CÁC HƯỚNG NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN ................................ 58 2.1. Nghiên cứu về các đối tượng sản xuất lysine ................................................... 58 2.1.1 Sử dụng dịch cỏ như một gradient trong sản xuất lysine ............................. 58 2.1.2 Đặc điểm con đường tổng hợp sinh học lysine trong Obligate Methylotroph Methylophilus methylotrophus............................................................................. 58 2.1.3. Các nghiên cứu về đối tượng sản xuất lysine là Corynebacterium glutamicum ......................................................................................................... 59 2.2. Công nghệ lên men L-lysine ............................................................................ 78 2.2.1. Nghiên cứu công nghệ sản xuất acid amin L-lysine .................................. 78 2.2.2. Khảo sát quá trình lên men bởi Corynebacterium glutamicum tự do và chế phẩm cố định để ứng dụng thu nhận L-lysine....................................................... 85 2.2.3. Nghiên cứu quá trình lên men thu nhận L-lysine ở các chế độ lên men khác nhau .................................................................................................................... 88 2.2.4. Nghiên cứu quá trình lên men liên tục L-lysine ......................................... 90 2.2.5. Nghiên cứu tổng hợp lysine bằng tế bào cố định ........................................ 96 CHƯƠNG 3: KẾT LUẬN ....................................................................................... 100 Tài liệu tham khảo ................................................................................................... 101 iv Danh mục hình Hình 1. 1 Hai dạng đồng phân quang học của lysine .................................................... 2 Hình 1. 2 Cấu trúc không gian của L-lysine. ................................................................ 2 Hình 1. 3 Nhu cầu của lysine, threonine và methionine trong thức ăn heo con và thành phần của những amino acid này chứa sẵn trong thưc vật . ............................................ 3 Hình 1. 4 Sản xuất lysine lên men (tấn/năm) trong suốt 3 thập kỉ qua . ........................ 4 Hình 1. 5 L-lysine sulphate . ........................................................................................ 4 Hình 1. 6 L-lysine HCl ................................................................................................ 5 Hình 1. 7 Sản phẩm thương mại L-lysine với B6 ........................................................ 6 Hình 1. 8 Sản phẩm thương ......................................................................................... 6 Hình 1. 9 Sản phẩm thương ......................................................................................... 7 Hình 1. 10 Sản phẩm thương mại ................................................................................. 7 Hình 1. 11 Sản phẩm thương mại Lysine-1000 90ct. .................................................... 8 Hình 1. 12 Sản phẩm thương mại Lysine Powder ........................................................ 8 Hình 1. 13 Sơ đồ tổng quát chuyển hóa tứ glucose ra lysine và các amino acid khác Hình 1. 14 Con đường tổng hợp lysine từ glucose . .................................................... 13 Hình 1. 15 Sự chuyển hóa tạo thành Oxaloacetate và Malate . ................................... 14 Hình 1. 16 Con đường tổng hợp lysine . ..................................................................... 16 Hình 1. 17 Sơ đồ diều hòa dị lập thể ......................................................................... 18 Hình 1. 18 Corynebacterium glutamicum . ................................................................. 20 Hình 1. 19 Hệ gen của Corynebacterium glutamicum. ............................................... 23 Hình 1. 20 Bản đồ cắt giới hạn của các plasmid pHM1519 và pBL1 của Corynebacterium glutamicum ................................................................................... 29 Hình 1. 21 Con đường tổng hợp phân nhánh của L-lysine trong giống Corynebacteria glutamicum hoang dại. . ............................................................................................. 32 Hình 1. 22 Cấu trúc của Aspartate kinase . ................................................................. 33 Hình 1. 23 Trình tự DNA của vùng promoter dapA . ................................................. 36 Hình 1. 24 Sơ đồ các phương pháp cố định tế bào . .................................................... 38 Hình 1. 25 Mô hình sản xuất các amino acid . ............................................................ 50 v Hình 1. 26 Mô hình lên men thu L-lysine . ................................................................. 51 Hình 2. 1 Cô lập gen ddh của C. glutamicum và cấu trúc của một plasmid tổ hợp C. glutamicum - E.coli . .................................................................................................. 68 Hình 2. 2 Nhuộm họat tính DDH sau polyacrylamide gel Electrophoresis . ............... 69 Hình 2. 3 Sơ đồ vật lý, phân tích và đánh dấu trình tự của DNA ................................ 70 vi Danh mục bảng Bảng 1. 1 So sánh các phương pháp thu nhận lysine . .................................................. 9 Bảng 1. 2 Đặc điểm hình thái của C. glutamicum ....................................................... 19 Bảng 1. 3 Thống kê lượng amino acid được sản xuất hiện nay. .................................. 24 Bảng 1. 4 Các plasmid nội sinh của Corynebacterium được sử dụng trong việc thiết kế vector . ....................................................................................................................... 28 Bảng 1. 5 Ảnh hưởng của số lượng bản sao dapA khác nhau trên tốc độ tăng trưởng, sự bài tiết L-lysine . ................................................................................................... 35 Bảng 2. 1 Các chủng vi khuẩn sản xuất acid L-glutamic hoang dại theo báo cáo như là chủng bố mẹ để sản xuất các amino acid và như là gen chủ cho nhân dòng . .............. 60 Bảng 2. 2 Kết quả thu được từ sáu chủng đột biến ở điều kiện lên men thu ................ 61 Bảng 2. 3 Hiệu quả của gen ddh trong C. glutamicum ............................................... 70 Bảng 2. 4 Cách sử dụng codon của gen ddh . ............................................................. 71 Bảng 2. 5 Giống C. glutamicum dùng trong bài nghiên cứu này . ............................... 73 Bảng 2. 6 Vị trí chuỗi primer đặc biệt được sử dụng phổ biến để thay thế trong G. glutamicum bằng phương pháp PCR và chuỗi DNA tiếp theo sau . ............................ 73 Bảng 2. 7 Sản lượng và những đặc trưng của sự sản xuất lysine của .......................... 75 Bảng 2. 8 Sinh khối và các chất chuyển hóa của C. glutamicum ATCC 13032 lysCfbr .................................................................................................................................. 77 Bảng 2. 9 Nhu cầu đồng hóa của C. glutamicum ATCC 13032 lysCfbr PEFTUfbp .... 78 Bảng 2. 10 Khả năng lên men của chủng CM24 trên 4 loại môi trường. ..................... 79 Bảng 2. 11 Ảnh hưởng của pH lên sản lượng L-lysine qui mô 50 lít. ......................... 80 Bảng 2. 12 Ảnh hưởng của oxy hòa tan lên sản lượng L-lysine ở qui mô 50 lít. ......... 81 Bảng 2. 13 Ảnh hưởng của oxy hòa tan lên sản lượng L-lysine ở qui mô 150 lít. ....... 82 Bảng 2. 14 Ảnh hưởng của oxy hòa tan lên sản lượng L-lysine ở qui mô 1500 lít. ..... 83 Bảng 2. 15 Hiệu suất thu hồi L-lysine. ....................................................................... 83 Bảng 2. 16 Tỷ lệ rửa trôi tế bào sau tái sử dụng lên men chế phẩm tế bào cố định (%). .................................................................................................................................. 87 vii Bảng 2. 17 Sản lượng L-lysine thu được bằng các phương pháp lên men khác nhau. . 89 Bảng 2. 18 Ảnh hưởng của hàm lượng đường giới hạn lên năng suất và sản lượng L- lysine. ........................................................................................................................ 89 Bảng 2. 19 Năng suất và sản lượng L-Lysine trong lên men repeat fed batch và liên tục.............................................................................................................................. 89 Bảng 2. 20 Ảnh hưởng của nồng độ CaCl2 lên sinh khối và nồng độ L-Lysine........... 97 Bảng 2. 21 Ảnh hưởng của lượng tế bào ban đầu và thời gian lên men lên sự tổng hợp .................................................................................................................................. 97 viii Danh mục đồ thị Đồ thị 2. 1 So sánh sản lượng L-lysine tạo bởi C. glutamicum từ sáu chủng đột biến trong môi trường lên men theo phương pháp Fed-batch . ........................................... 62 Đồ thị 2. 2 Hoạt động invivo của fructose 1,6-biphosphatase trong các chủng C. glutamicum khác nhau .................................................................................................. 75 Đồ thị 2. 3 Ảnh hưởng của thời gian lên men lên sinh khối và sản lượng L-lysine ở qui mô 50 lít ..................................................................................................................... 79 Đồ thị 2. 4 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sản lượng L-lysine ở qui mô 50 lít. ............... 80 Đồ thị 2. 5 Ảnh hưởng của thời gian lên men lên sinh khối và sản lượng L-lysine ở qui mô 150 lít. ................................................................................................................. 81 Đồ thị 2. 6 Ảnh hưởng của thời gian lên men lên sinh khối và sản lượng ................... 82 Đồ thị 2. 7 Sản lượng L-lysine của các lần tái sử dụng lên men bằng các chế phẩm ... 87 Đồ thị 2. 8 Thời gian nuôi cấy liên tục ....................................................................... 91 Đồ thị 2. 9 Ảnh hưởng của tỉ lệ pha loãng lên các thông số trạng thái ổn định ........... 92 Đồ thị 2. 10 Ảnh hưởng của tỉ lệ đường bổ sung lên năng suất ................................... 93 Đồ thị 2. 11 Ảnh hưởng của khuấy đảo lên các thông số trạng thái ổn định. ............... 94 Đồ thị 2. 12 Ảnh hưởng của khí giàu oxy lên các thông số trạng thái ổn định. ........... 95 Đồ thị 2. 13 Ảnh hưởng của lượng tế bào ban đầu lên sự tổng hợp L-lysine bằng các tế bào C.glutamicum cố định ......................................................................................... 98 Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu 1 CHƯƠNG I : TỔNG QUAN 1. 1.Giới thiệu về lysine: 1.1.1. Khái niệm: Lysine là một α-amino acid thiết yếu con người không thể tổng hợp được. Lysine chứa hai nhóm (-NH2) và một nhóm (-COOH). Trong cấu tạo phân tử lysine có một carbon bất đối xứng nên chúng có hai dạng đồng phân quang học: D-lysine và L-lysine. Hai đồng phân quang học này có tính chất hóa lý giống nhau, chỉ khác nhau khả năng làm quay mặt phẳng phân cực ánh sáng, một sang phải và một sang trái làm tính chất sinh học của chúng hoàn toàn khác và cơ thể sinh vật sống chỉ hấp thu được lysine dạng L. Lysine tồn tại dạng rắn và tinh thể trong điều kiện bình thường, bị phân hủy ở nhiệt độ 200-300°C, có màu tím xanh khi tương tác với ninhydrin [38]. Lysine là một trong 9 amino acid không thay thế trong tổng số 20 amino acid, tìm thấy trong cấu trúc của những phân tử protein tự nhiên của tất cả sinh vật sống và được tổng hợp từ vi sinh vật. Lysine thuộc họ aspartate, được tổng hợp qua con đường phân nhánh. Lysine là acid amin rất cần thiết cho hoạt động sống của người và động vật. Nhu cầu lysine trên thế giới năm 2006 là 950,000-1000,000 tấn. 1.1.2. Cấu tạo: Công thức phân tử: C6H14N2O2, khối lượng phân tử 146,188 g/mol, điểm đẳng điện pH = 9.59, Codon của lysine là AAA và AAG. [38] Công thức cấu tạo: NH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH(NH2)-COOH Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu 2 Hình 1. 1 Hai dạng đồng phân quang học của lysine [38]. Hình 1. 2 Cấu trúc không gian của L-lysine [38]. Tên gọi: Lysine còn có tên gọi khác là axit α-e-diaminocaproic và 2,6- diaminohexanoic acid. 1.1.3. Vai trò và ứng dụng: Lysine giữ vai trò sống còn trong tổng hợp protein, là chìa khóa trong sản xuất enzyme, hoocmon và các kháng thể giúp cơ thể tăng cường sức đề kháng, chống bệnh tật đặc biệt ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh mụn gộp môi hay mụn gộp sinh dục. Cơ thể người và động vật thiếu lysine cơ thể sẽ không hoạt động bình thường, đặc biệt ở động vật còn non và trẻ em sẽ xảy ra hiện tượng chậm lớn, trí tuệ phát triển kém. Chính vì thế lysine thường được đưa vào phần ăn của trẻ và của gia súc. L-lysine là một amino acid cần thiết và đòi hỏi phải luôn có sẵn trong thức ăn để đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng của động vật, đặc biệt đối với thức ăn từ ngũ cốc, lúa mì hoặc lúa mạch thì nghèo lysine. Do đó bổ sung nguồn giàu lysine vào là D-lysine L-Llysine Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu 3 cần thiết để tăng hiệu quả thức ăn. Ta có thể bổ sung bột đậu nành (chứa nhiều lysine) hoặc thêm trực tiếp lysine vào thức ăn. Ưu điểm của việc bổ sung trực tiếp lysine là các amino acid không thay thế khác không được thêm vào nên thành phần của chúng trong cơ thể không bị thay đổi. Ví dụ thêm 0.5% lysine tăng chất lượng đạm của thức ăn hiệu quả như là bổ sung 20% đậu nành. Từ đó, nitơ của amino acid không giới hạn thêm vào thừa của chế độ ăn có hàm lượng đạm cao thì sẽ bị chuyển hóa thành amoni và được động vật bài tiết ra ngoài, với việc bổ sung lysine làm giảm lượng đạm bổ sung từ đó làm giảm ô nhiễm môi trường từ phân. Hình 1. 3 Nhu cầu của lysine, threonine và methionine trong thức ăn heo con và thành phần của những amino acid này chứa sẵn trong thưc vật [34]. Trong năm 2000, việc sản xuất L-lysine khắp nơi trên thế giới được sử dụng như là một nguồn chất bổ sung vào thức ăn đạt sấp xỉ 550.000 tấn và trên thị trường vẫn cho thấy một sự tăng trưởng tiềm năng từ 7-10% mỗi năm [34]. Vì chỉ có L-lysine là có hiệu quả như là một nguồn chất bổ sung và tất cả các quy trình sản xuất hiện nay sử dụng phương pháp lên men quen thuộc. Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu 4 Hình 1. 4 Sản xuất lysine lên men (tấn/năm) trong suốt 3 thập kỉ qua [34]. Lysine có nhiều trong trứng, thịt, cá, đậu nành…nhưng dễ bị phá hủy trong quá trình chế biến và nấu nướng thức ăn. Người ta bổ sung lysine cho động vật dưới dạng thức ăn như cho lysine vào sữa. Ở người lysine được bổ sung vào thuốc dạng viên và thuốc uống. 1.1.4. Các dạng tồn tại của lysine:  L-lysine Sulphate Hình 1. 5 L-lysine sulphate [18]. Thành phần: Lysine Sulphate là muối sulphate với lysine L-lysine : 51% min, trung bình là 65%.. Sulphate : 15% max Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu 5 Các acid amin : 10% min. Độ ẩm : 3% max Muối amoni (như NH4) : 1% ma Kim loại nặng : 0,003% max Arsen : 0,0002% max. Lysine Sulphate có thể được bổ sung vào L-lysine HCl làm thức ăn cho vật nuôi, chúng có hiệu quả như L-lysine HCl. 