Luận văn Hiệu quảcủa benzyl adenine, naphthaleneacetic acid, indole-3-butyric acid và than hoạt tính trên sựnhân chồi và tạo rễ cây gấc (momordica cochinchinensis(lour.) spreng.) in vitro

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

 TRƯƠNG THỊ KIM CHUNG HIỆU QUẢ CỦA BENZYL ADENINE, NAPHTHALENEACETIC ACID, INDOLE-3-BUTYRIC ACID VÀ THAN HOẠT TÍNH TRÊN SỰ NHÂN CHỒI VÀ TẠO RỄ CÂY GẤC (Momordica cochinchinensis (Lour.) Spreng.) IN VITRO LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KỸ SƯ TRỒNG TRỌT Cần Thơ-02/2007 2 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

 TRƯƠNG THỊ KIM CHUNG HIỆU QUẢ CỦA BENZYL ADENINE, NAPHTHALENEACETIC ACID, INDOLE-3-BUTYRIC ACID VÀ THAN HOẠT TÍNH TRÊN SỰ NHÂN CHỒI VÀ TẠO RỄ CÂY GẤC (Momordica cochinchinensis (Lour.) Spreng.) IN VITRO LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KỸ SƯ TRỒNG TRỌT Cần Thơ-02/2007 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS. TS. LÊ VĂN HOÀ ThS. NGUYỄN QUỐC HỘI CN. NGUYỄN VĂN ÂY 3 LỜI CẢM TẠ Kính dâng Cha mẹ suốt đời tận tuỵ vì tương lai của con. Chân thành biết ơn: Thầy Lê Văn Hoà đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi hoàn thành tốt bài luận văn này. Thầy Nguyễn Quốc Hội đã thường xuyên góp ý, tận tình hướng dẫn và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành tốt đề tài này. Quí thầy cô đã tận tâm dìu dắt tôi trong suốt quá trình tôi theo học tại trường. Anh Nguyễn Văn Ây đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài này. Các thầy cô cùng các anh chị, các bạn trong Bộ Môn Sinh Lý- Sinh Hoá đã giúp đỡ tôi thực hiện tốt luận văn. Các bạn sinh viên lớp Trồng Trọt K28 đã giúp đỡ tôi, động viên tôi trong những năm tháng trên giảng đường Đại Học. Thân ái gởi về: Các bạn sinh viên khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng, lời chúc thành công và sức khoẻ. Cần Thơ, ngày….tháng 02 năm 2007 Trương Thị Kim Chung 4 TIỂU SỬ CÁ NHÂN Họ và tên: Trương Thị Kim chung Sinh ngày: 09/04/1981 Nơi sinh: Thới Hoà-Trà Ôn-Vĩnh Long Con ông Trương Văn Que và bà Nguyễn Thị Phiến Năm 2001 tốt nghiệp trường Trung Học Phổ Thông Hựu Thành - Trà Ôn - Vĩnh Long. Năm 2002- 2007 sinh viên Lớp Trồng Trọt khoá 28, khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng, trường Đại Học Cần Thơ. Năm 2007 tốt nghiệp chuyên ngành Trồng Trọt, khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng, trường Đại Học Cần Thơ. 5 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân. Các số liệu kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình luận văn nào trước đây. Tác giả luận văn Trương Thị Kim Chung 6 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN SINH LÝ-SINH HÓA Chứng nhận luận văn tốt nghiệp Kỹ sư Trồng Trọt với đề tài: HIỆU QUẢ CỦA BENZYL ADENINE, NAPHTHALENEACETIC ACID, INDOLE-3-BUTYRIC ACID VÀ THAN HOẠT TÍNH TRÊN SỰ NHÂN CHỒI VÀ TẠO RỄ CÂY GẤC (Momordica cochinchinensis (Lour.) Spreng.) IN VITRO Do sinh viên TRƯƠNG THỊ KIM CHUNG thực hiện. Kính trình lên hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp. TP Cần Thơ, ngày…..tháng…..năm 2007 Cán bộ hướng dẫn Lê Văn Hoà 7 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN SINH LÝ-SINH HÓA Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp đã chấp nhận luận văn đính kèm với đề tài: HIỆU QUẢ CỦA BENZYL ADENINE, NAPHTHALENEACETIC ACID, INDOLE-3-BUTYRIC ACID VÀ THAN HOẠT TÍNH TRÊN SỰ NHÂN CHỒI VÀ TẠO RỄ CÂY GẤC (Momordica cochinchinensis (Lour.) Spreng.) IN VITRO Do sinh viên: TRƯƠNG THỊ KIM CHUNG thực hiện và bảo vệ trước hội đồng. Luận văn tốt nghiệp đã được hội đồng đánh giá ở mức: ............................... Ý kiến hội đồng:........................................................................................... ..................................................................................................................... ..................................................................................................................... ..................................................................................................................... ..................................................................................................................... ..................................................................................................................... Duyệt khoa Nông Nghiệp & SHƯD Cần Thơ, ngày…tháng…năm 2007 CHỦ NHIỆM KHOA CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG 8 MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cảm tạ Tiểu sử cá nhân................................................................................. i Lời cam đoan................................................................................... ii Chứng nhận luận văn tốt nghiệp......................................................iii Chấp nhận luận văn của Hội Đồng.................................................. iv Mục lục ........................................................................................... v Danh sách bảng.............................................................................viii Danh sách hình ............................................................................... ix Tóm lược ......................................................................................... x ĐẶT VẤN ĐỀ: .................................................................................................. 1 Chương I: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU .................................................................. 3 1.1 NGUỒN GỐC, PHÂN LOẠI, ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ SINH THÁI ........................................................................................... 3 1.1.1 Nguồn gốc và phân loại ............................................................. 3 1.1.2 Đặc điểm hình thái.................................................................... 3 1.1.3 Đặc điểm sinh thái ..................................................................... 4 1.2 PHƯƠNG PHÁP NHÂN GIỐNG CỔ TRUYỀN .................................... 4 1.3 THÀNH PHẦN DINH DƯỠNG, CÔNG DỤNG VÀ GIÁ TRỊ KINH TẾ ................................................................................. 5 1.3.1 Thành phần dinh dưỡng............................................................. 5 1.3.2 Công dụng................................................................................. 6 1.3.3 Nghiên cứu và ứng dụng............................................................ 7 1.4 NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT........................................... 8 1.4.1 Giới thiệu................................................................................... 8 1.4.2 Quá trình vi nhân giống.............................................................. 8 1.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy ............................. 12 Chương II: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP................................................... 21 9 2.1 PHƯƠNG TIỆN .......................................................................................... 21 2.1.1 Thời gian và địa điểm .............................................................. 21 2.1.2 Vật liệu ................................................................................... 21 2.1.3 Thiết bị và dụng cụ ................................................................. 21 2.1.4 Hoá chất ................................................................................. 21 2.1.5 Điều kiện phòng nuôi cấy......................................................... 21 2.2 PHƯƠNG PHÁP ....................................................................................... 22 2.2.1 Môi trường nuôi cấy ............................................................... 22 2.2.2 Cách tiến hành ........................................................................ 22 2.2.2.1 Thí nghiệm 1: Hiệu quả của Benzyl Adenine (BA), Indolylbutyric acid (IBA) đến sự tạo chồi gấc in vitro..................................................... 22 2.2.2.2 Thí nghiệm 2: Hiệu quả của Naphthaleneacetic acid (NAA) và than hoạt tính trên sự tạo rễ chồi gấc in vitro ................................................ 23 2.2.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng thích ứng ban đầu của cây gấc khi chuyển từ ống nghiệm ra vườn ươm trên 3 nền giá thể khác nhau: tro trấu, xơ dừa, tro trấu + xơ dừa (1:1) ...................... 24 Chương III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 26 3.1 Thí nghiệm 1: Hiệu quả của BA và IBA đến sự sinh trưởng của chồi gấc in vitro ......................................................... 26 3.1.1 Chiều cao chồi gia tăng (cm) .................................................. 26 3.1.2 Trọng lượng cụm chồi gia tăng (g) .......................................... 28 3.1.3 Số chồi lớn ............................................................................. 30 3.1.4 Số lượng chồi nhỏ ................................................................... 31 3.1.5 Hệ số nhân giống .................................................................... 34 3.2 Thí nghiệm 2: Hiệu quả của Naphthaleneacetic acid (NAA) và than hoạt tính trên sự tạo rễ chồi gấc in vitro ............................................................................... 37 10 3.2.1 Trọng lượng cụm chồi gia tăng (g) .......................................... 37 3.2.2 Chiều cao gia tăng (cm) .......................................................... 39 3.2.3 Số lá ....................................................................................... 41 3.2.4 Số rễ ....................................................................................... 43 3.2.5 Chiều dài rễ (cm) .................................................................... 44 3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng thích ứng ban đầu của cây gấc khi chuyển từ ống nghiệm ra vườn ươm trên 3 nền giá thể khác nhau: tro trấu, xơ dừa, tro trấu + xơ dừa (1:1) ............................. 49 3.3.1 Tỷ lệ sống (%) ........................................................................ 49 3.3.2 Chiều cao gia tăng (cm) .......................................................... 50 3.3.3 Số lá ....................................................................................... 51 Chương IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................... 55 4.1 KẾT LUẬN ....................................................................................... 55 4.2 ĐỀ NGHỊ .......................................................................................... 55 QUI TRÌNH NHÂN GIỐNG GẤC IN VITRO ............................................ 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................... 57 PHỤ CHƯƠNG .......................................................................................... 59 11 DANH SÁCH BẢNG STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Tựa bảng Hiệu quả của BA và IBA lên sự gia tăng chiều cao cụm chồi của mẫu chồi gấc in vitro theo thời gian (tuần sau khi cấy) Hiệu quả của BA và IBA lên sự gia tăng trọng lượng cụm chồi của mẫu chồi gấc in vitro theo thời gian (tuần sau khi cấy) Hiệu quả của BA và IBA lên sự hình thành số lượng chồi lớn của mẫu chồi gấc in vitro theo thời gian (tuần sau khi cấy) Hiệu quả của BA và IBA lên sự hình thành số lượng chồi nhỏ của mẫu chồi gấc in vitro theo thời gian (tuần sau khi cấy) Hiệu quả của NAA và than hoạt tính trong sự gia tăng trọng lượng cụm chồi gấc in vitro vào thời điểm 5 tuần sai khi cấy Hiệu quả của NAA và than hoạt tính lên sự gia tăng chiều cao của cụm chồi gấc in vitro vào thời điểm 5 tuần sau khi cấy Hiệu quả của NAA và than hoạt tính lên sự gia tăng số lá của mẫu chồi gấc in vitro vào thời điểm 5 tuần sau khi cấy Hiệu quả của NAA và than hoạt tính lên sự hình thành số rễ của mẫu chồi gấc in vitro vào thời điểm 5 tuần sau khi cấy Hiệu quả của NAA và than hoạt tính lên chiều dài rễ của mẫu chồi gấc in vitro vào thời điểm 5 tuần sau khi cấy Hiệu quả của 3 loại giá thể và nylon lên tỷ lệ cây sống của cây gấc in vitro sau 4 tuần giâm Hiệu quả của 3 loại giá thể và nylon lên chiều cao cây gia tăng của cây gấc in vitro sau 4 tuần giâm Hiệu quả của 3 loại giá thể và nylon lên sự gia tăng số lá của cây gấc in vitro sau 4 tuần giâm Trang 27 29 31 32 38 40 42 44 45 50 51 52 12 DANH SÁCH HÌNH STT 1 2 3 4 5 6 7 Tựa hình Đường cong diễn tả mức độ đáp ứng điển hình đối với nồng độ chất điều hoà sinh trưởng Mối tương quan giữa hàm lượng auxin và cytokinin trong nuôi cấy mô Sự sinh trưởng của chồi gấc in vitro ở các nghiệm thức có nồng độ BA khác nhau vào thời điểm 6 TSKC Sự sinh trưởng của chồi gấc in vitro ở các nghiệm thức có nồng độ BA và IBA khác nhau vào thời điểm 6 TSKC Hiệu quả của NAA và than hoạt tính lên sự tạo rễ của mẫu chồi gấc in vitro vào thời điểm 5 tuần sau khi cấy Hiệu quả của NAA lên sự tạo rễ của mẫu chồi gấc in vitro vào thời điểm 5 tuần sau khi cấy Sự sinh trưởng của gấc in vitro sau 4 tuần giâm Trang 18 20 35 36 47 48 54 13 Trương Thị Kim Chung, 2007. Hiệu quả của Benzyl Adenine, Naphthaleneacetic acid, Indole-3-butyric acid và than hoạt tính trên sự nhân chồi và tạo rễ cây gấc (Momordica cochinchinensis (Lour.) Spreng.) in vitro. Luận văn tốt nghiệp Kỹ sư Trồng Trọt, Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại học Cần Thơ. Cán bộ hướng dẫn PGS.TS. Lê Văn Hoà, ThS. Nguyễn Quốc Hội và CN. Nguyễn Văn Ây. TÓM LƯỢC Đề tài “Hiệu quả của Benzyl Adenine, Naphthaleneacetic acid, Indole-3- butyric acid và than hoạt tính trên sự nhân chồi và tạo rễ cây gấc (Momordica cochinchinensis (Lour.) Spreng.) in vitro” được thực hiện tại phòng nuôi cấy mô thực vật thuộc Bộ môn Sinh Lý - Sinh Hoá, khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng, trường Đại học Cần Thơ, từ tháng 08/2006 đến tháng 02/2007. Các thí nghiệm được tiến hành nhằm mục đích tìm ra môi trường có nồng độ chất điều hoà sinh trưởng thích hợp để nhân chồi và tạo rễ cây gấc. Sử dụng môi trường cơ bản MS có bổ sung BA, IBA trong thí nghiệm tạo chồi; có bổ sung NAA và than hoạt tính trong thí nghiệm tạo rễ in vitro và sử dụng ba loại giá thể xơ dừa, tro trấu, xơ dừa + tro trấu (1:1) kết hợp với nylon giữ ẩm trong thí nghiệm thuần dưỡng cây gấc ex vitro. Kết quả ghi nhận cho thấy: - Môi trường có 0,2 ppm BA + 0,02 ppm IBA cho số chồi nhiều nhất. - Môi trường có 0,2 ppm NAA + than hoạt tính 2 g/l thích hợp cho tạo rễ in vitro cây gấc. - Chất nền tro trấu kết hợp với nylon giữ ẩm tỏ ra thích hợp cho bước đầu thuần dưỡng cây gấc in vitro. 14 ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, khi khoa học kỹ thuật ngày càng phát triển, con người càng lạm dụng quá mức các chế phẩm hoá học độc hại. Từ phẩm màu trong thức ăn, hàn the, formol, các chất bảo quản nông sản, thực phẩm, thuốc trừ sâu chưa phân huỷ hết trong rau quả, các sản phẩm hoá dược, hoá mỹ phẩm,...đã gây nhiễm độc tiềm tàng và nhiều bệnh nguy hiểm. Đặc biệt là hiện tượng rụng tóc, bệnh ung thư, sần da và rất nhiều chứng bệnh khác. Với phương châm “phòng bệnh hơn chữa bệnh” của ngành y tế, việc tìm về với thiên nhiên để nghiên cứu, khai thác và phát triển các loại thuốc bổ, các chế phẩm dùng trong thực phẩm nhằm tăng cường sức khoẻ cho cộng đồng, ngăn ngừa bệnh tật, đang là vấn đề cấp bách và ngày càng được đẩy mạnh trên thế giới cũng như ở Việt Nam. Việt Nam là một trong số ít quốc gia có đặc điểm địa lý và khí hậu đa dạng, có một hệ thống y học cổ truyền phát triển từ lâu đời với nhiều loại cây thuốc là nguồn nguyên liệu chủ yếu. Trong đó, gấc (Momordica cochinchinesis (Lour.) Spreng.) là loại cây có giá trị dược liệu vô cùng quí giá, được ghi vào Dược điển Việt Nam (1983) và Dược điển Trung Quốc (1963), (1997). Theo y học cổ truyền, tất cả các bộ phận của gấc đều là vị thuốc. Đặc biệt là hàm lượng ß-carotene (tiền chất vitamin A) rất cao. Đây là nguồn vitamin A thiên nhiên vô cùng quí giá, có tác dụng phòng và chữa bệnh thiếu vitamin A là nguyên nhân gây khô giác mạc mắt, bệnh quáng gà, suy dinh dưỡng và chậm lớn ở trẻ em (Đỗ Tất Lợi, 2003). Gấc được tìm thấy ở nhiều nơi trên thế giới như Philipin, Thái Lan, miền nam Trung Quốc, Miến Điện, Lào và Campuchia (Le Thuy Vuong, 2002). Ở Việt Nam gấc mọc hoang hay được trồng khắp nơi nhiều nhất là các vùng phía Bắc. Gấc là loại dây leo dễ trồng, không tốn đất, chi phí đầu tư thấp. Gấc có thể trồng bằng hạt hay giâm cành, nhưng hệ số nhân giống không cao (Đỗ Tất Lợi, 2003). Thêm vào đó gấc là loại cây đơn tính biệt chu (cây đực và cây cái riêng), nếu trồng bằng hạt thì sau một thời gian mới xác định được là cây đực hay cây cái mà cây đực thì không cho quả. Điều này vừa mất công chăm sóc, vừa tốn thời gian và chi phí. Vì 15 vậy, phương pháp nhân giống cổ truyền không thể cung cấp đủ lượng cây giống cho qui mô sản xuất lớn, đáp ứng nhu cầu thị trường. Để giải quyết các trở ngại trên thì nhân giống bằng phương pháp in vitro đã và đang chứng tỏ là một phương pháp có ý nghĩa quan trọng cho công tác giống cây trồng, mang lại hiệu quả kinh tế cao. Đây là phương pháp giúp tạo ra một số lượng lớn giống cây trồng đồng nhất trong một thời gian ngắn, giúp duy trì được các tính trạng tốt từ thế hệ trước sang thế hệ sau, cải tiến các giống cây trồng và tạo cây sạch bệnh. Do vậy, đề tài nghiên cứu “Hiệu quả của Benzyl adenine, Naphthaleneacetic acid, Indole-3-butyric acid và than hoạt tính trên sự tạo chồi và rễ cây gấc (Momordica cochinchinensis (Lour.) Spreng.) in vitro” được tiến hành nhằm tìm ra hàm lượng cytokinin và auxin thích hợp cho sự tạo chồi và rễ cây gấc in vitro. 16 CHƯƠNG I LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 1.1 NGUỒN GỐC, PHÂN LOẠI, ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ SINH THÁI 1.1.1 Nguồn gốc và phân loại Gấc có tên khoa học là Momordica cochinchinesis (Lour.) Spreng., thuộc bộ Vioales, họ Bầu bí (Cucurbitaceae), chi Momordica L, loài Cochinchinensis. Tên nước ngoài: Mộc Miết (Trung Quốc), Muricic (Pháp), Cochinchina Momordica (Anh) (Phạm Hoàng Hộ, 1999). Gấc có khoảng 45 loài trên thế giới, tập trung chủ yếu ở vùng nhiệt đới Châu Phi, Châu Mỹ và Châu Á có 5-7 loài, trong đó Việt Nam có 4 loài (M. Karaudren, 1975 và Nguyễn Hữu Tiến, 1994, trích dẫn bởi Phạm Hoàng Hộ, 1999). 1.1.2 Đặc điểm hình thái Gấc là loại dây leo bám trên giàn, bờ tường hay các cây có tán lá rộng, phân bố ở độ cao 0-15 m. Gấc sống lâu năm nhờ rễ củ, mỗi năm tàn một lần, nhưng lại đâm chồi từ gốc cũ vào mùa xuân năm sau (Đỗ Tất Lợi, 2003). Mỗi gốc có nhiều cây, mỗi cây có nhiều đốt, mỗi đốt có lá. Lá cây gấc mọc so le, có từ 3-5 thuỳ khía sâu tới ½ phiến lá, mặt trên lá màu xanh lục sẫm, mặt dưới lá có lông nhám, lúc đầu lá có lông ở mặt trên, sau đó nhẵn. Gân lá có hình chân vịt. Cuống lá dài từ 2-3 cm. Tua cuốn to, đơn nằm giáp với gốc lá (Đỗ Tất Lợi, 2003). Gấc là loại cây đơn tính biệt chu, hoa đực và hoa cái riêng. Hoa đực mọc ở kẽ lá, lá bắc hình thận to và rộng; đài có ống ngắn, các thuỳ hình tam giác nhọn, màu lam sẫm; tràng có 5 cánh, màu trắng hoặc ngã vàng, hình trứng thuôn, có lông ở mặt trong, 5 nhị. Hoa cái có lá bắc nhỏ, bầu xù xì (Đỗ Tất Lợi, 2003). Quả hình bầu dục hoặc hình trứng dài từ 15-20 cm, có cuống mập, đáy nhọn, ngoài có nhiều gai, khi chín màu vàng đỏ. Trong quả có nhiều hạt sếp thành hàng dọc, quanh hạt có màu đỏ máu được gọi là thịt gấc. Hạt gấc dẹt, có hình dạng gần giống con ba ba nhỏ, màu đen hoặc hơi xám, vỏ ngoài rất cứng, mép có răng cưa, dày từ 5-6 mm, trong hạt có nhân trắng chứa nhiều dầu (Phạm Hoàng Hộ, 1999). 17 Gấc có giống quả chín màu đỏ và giống quả màu vàng. Giống quả vàng hiện thấy trồng ở một số vùng miền núi thuộc tỉnh Lai Châu và Sơn La. Giống quả đỏ có hai loại: quả to và quả nhỏ, đều được trồng nhiều ở vùng trung du và đồng bằng Bắc Bộ. Theo kinh nghiệm của nhân dân ở một số vùng thuộc tỉnh Hải Hưng, gấc có loại tẻ và loại nếp: gấc tẻ có tên khác là gấc giun (Hưng Yên), ruột màu đỏ, ăn không ngấy (béo) (màu này nhạt đi khi nấu chín), quả to, rất sai, gai quả dày, nhiều hạ