Luận văn Nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn n - Hexan của cây an điền nón hedyotis pilulifera (pit.) t.n.ninh - Rubiaceae

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC LÊ THỊ THANH PHƯƠNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC PHÂN ĐOẠN N-HEXAN CỦA CÂY AN ĐIỀN NÓN HEDYOTIS PILULIFERA (PIT.) T.N.NINH - RUBIACEAE LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ ĐẠI HỌC Người hướng dẫn khoa học: ThS. NGUYỄN KHÁNH THÙY LINH Huế, 2016 Lời Cảm Ơn Để hoàn thành luận văn này em xin chân thành cảm ơn: Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo Đại học Trường Đại học Y Dược Huế đã tạo điều kiện cho em được làm luận văn tốt nghiệp. Ban Chủ nhiệm Khoa, các thầy cô và cán bộ trong khoa Dược đã giúp đỡ, ủng hộ và tạo điều kiện về cơ sở vật chất, trang thiết bị để em có thể tiến hành các thử nghiệm trong quá trình làm luận văn. TS. Nguyễn Thế Cường - Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giám định tên khoa học cho đối tượng nghiên cứu. Các anh chị, các bạn trong nhóm làm đề tài cũng như các bạn lớp Dược 5 đã giúp đỡ, động viên, trao đổi kiến thức và kinh nghiệm trong suốt quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp. Xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đã luôn ở bên cạnh động viên về tinh thần và hỗ trợ về vật chất để luận văn này được hoàn thành một cách tốt nhất. Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ThS. Nguyễn Khánh Thùy Linh giảng viên bộ môn Dược liệu – Dược cổ truyền, Khoa Dược – Trường Đại học Y Dược Huế người đã tận tình hỗ trợ, hướng dẫn và truyền đạt cho em nhiều kiến thức bổ ích trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Sinh viên Lê Thị Thanh Phương LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn này là công trình nghiên cứu do chính tôi thực hiện. Các số liệu và kết quả trong luận văn này là hoàn toàn trung thực, chính xác và chƣa đƣợc công bố trong bất kì công trình nào khác. Huế, tháng 5 năm 2016 Sinh viên Lê Thị Thanh Phƣơng DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT 13 C-NMR : Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy 1 H-NMR : Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Ac : Acetyl Ab : beta-amyloid ABTS : 2,2-azinobis-3-ethylbenzothiozoline-6-sulfonic acid AD : Alzheimer’s disease Alpha-TQ : α-tocopherol quinone DPHH : 1,1-diphenylpicrylhydrazyl EC50 : The half maximal effective concentration FTC : Ferricthio cyanate HMBC : Heteronuclear multiple bond correlation HSQC : Heteronuclear single quantum correlation IC50 : The haft maximal Inhibition concentration IL : Interleukin MCF-7 : Tế bào ung thƣ biểu mô vú ngƣời Me : Methy MIC : Minimal Inhibitory Concentration ppm : Parts per million PTP1B : Protein tyrosine phosphatase 1B SKC : Sắc ký cột SKLM : Sắc ký lớp mỏng TBA : Thiobarbituric acid TLTK : Tài liệu tham khảo TNF-α : Tumor necrosis factor alpha v/v : Thể tích/thể tích MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1 Chƣơng 1: TỔNG QUAN ......................................................................................... 3 1.1. GIỚI THIỆU VỀ HỌ CÀ PHÊ (RUBIACEAE) .............................................. 3 1.2. GIỚI THIỆU VỀ CHI AN ĐIỀN (HEDYOTIS L.) .......................................... 3 1.2.1. Đặc điểm thực vật và phân bố .................................................................... 3 1.2.2. Thành phần hóa học ................................................................................... 4 1.2.2.1. Lớp chất alkaloid ................................................................................. 4 1.2.2.2. Lớp chất flavonoid ............................................................................... 6 1.2.2.3. Lớp chất anthraquinone ...................................................................... 7 1.2.2.4. Lớp chất triterpenoid và sterol ............................................................ 8 1.2.2.5. Lớp chất iridoid ................................................................................... 9 1.2.2.6. Các hợp chất khác ............................................................................. 10 1.2.3. Tác dụng dƣợc lý và hoạt tính sinh học ................................................... 10 1.2.3.1. Hoạt tính gây độc tế bào .................................................................... 10 1.2.3.2. Hoạt tính chống oxy hóa và bảo vệ gan. ........................................... 12 1.2.3.3. Hoạt tính kháng vi sinh vật ................................................................ 13 1.2.3.4. Hoạt tính giảm đau, kháng viêm. ....................................................... 14 1.2.3.5. Hoạt tính chống loét .......................................................................... 14 1.2.3.6. Hoạt tính bảo vệ thần kinh ................................................................ 14 1.2.4. Công dụng ................................................................................................ 15 1.3. CÂY AN ĐIỀN NÓN HEDYOTIS PILULIFERA (Pit.) T.N.Ninh ................ 15 1.3.1. Vị trí phân loại ......................................................................................... 15 1.3.2. Đặc điểm thực vật – Phân bố ................................................................... 16 1.3.3. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học ............................................... 16 Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 17 2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ........................................................................ 17 2.2. VẬT LIỆU ...................................................................................................... 18 2.2.1. Hóa chất ................................................................................................... 18 2.2.2. Máy móc – thiết bị ................................................................................... 18 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................. 18 2.3.1. Phƣơng pháp chiết xuất ............................................................................ 18 2.3.1.1. Phương pháp tạo dịch chiết toàn phần.............................................. 18 2.3.1.2. Phương pháp chiết xuất phân đoạn lỏng – lỏng ............................... 19 2.3.1.3. Phương pháp chiết pha rắn ............................................................... 19 2.3.2. Phƣơng pháp phân lập .............................................................................. 19 2.3.2.1. Sắc ký cột hấp phụ ............................................................................. 19 2.3.2.2. Sắc ký lọc qua gel .............................................................................. 20 2.3.2.3. Sắc ký trao đổi ion ............................................................................. 20 2.3.2.4. Phương pháp sắc ký lớp mỏng .......................................................... 20 2.3.3. Phƣơng pháp xác định cấu trúc ................................................................ 21 2.3.4. Phƣơng pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn ......................................... 22 2.3.4.1. Phương pháp ...................................................................................... 22 2.3.4.2. Cách tiến hành ................................................................................... 22 Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................................. 23 3.1. KẾT QUẢ CỦA QUÁ TRÌNH CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP .................. 23 3.1.1. Quá trình chiết xuất .................................................................................. 23 3.1.2. Quá trình phân lập .................................................................................... 24 3.2. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƢỢC ................ 27 3.2.1. Xác định cấu trúc hợp chất HP1 .............................................................. 27 3.2.2. Xác định cấu trúc hợp chất HP2 .............................................................. 30 3.3. KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC ................................................... 32 Chƣơng 4: BÀN LUẬN .......................................................................................... 34 4.1. BÀN LUẬN CHUNG .................................................................................... 34 4.2. QUÁ TRÌNH THU THẬP VÀ XỬ LÝ MẪU ............................................... 35 4.3. QUÁ TRÌNH CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP .............................................. 36 4.4. VỀ CÁC CHẤT PHÂN LẬP ĐƢỢC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC ........... 38 KẾT LUẬN .............................................................................................................. 43 KIẾN NGHỊ ............................................................................................................. 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Một số alkaloid tiêu biểu đƣợc phân lập từ chi Hedyotis L. ..................... 5 Hình 1.2. Anthraquinone từ chi Hedyotis L. ............................................................. 8 Hình 2.1. Hình ảnh cây An điền nón (Hedyotis pilulifera (Pit.) T.N.Ninh) ........... 17 Hình 3.1. Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn từ cây An điền nón ............................... 24 Hình 3.2. Sơ đồ phân lập hợp chất HP1 và HP2 từ phân đoạn H34 ...................... 27 Hình 3.3. Cấu trúc hóa học của hợp chất HP1 ........................................................ 30 Hình 3.4. Tƣơng tác HMBC chính của hợp chất HP1 ............................................ 30 Hình 3.5. Cấu trúc hoá học của hợp chất HP2 ......................................................... 30 Hình 3.6. Tƣơng tác HMBC chính của hợp chất HP2 ............................................. 30 Hình 4.1. Cấu trúc hóa học của HP1 ....................................................................... 39 Hình 4.2. Cấu trúc hóa học của HP2 ....................................................................... 39 DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Một số alkaloid tiêu biểu đƣợc phân lập từ chi Hedyotis .......................... 5 Bảng 1.2. Flavonoid từ chi Hedyotis .......................................................................... 6 Bảng 1.3. Anthraquinone từ chi Hedyotis .................................................................. 7 Bảng 1.4. Một số triterpenoid và sterol từ chi Hedyotis ............................................. 8 Bảng 1.5. Những hợp chất iridoid phổ biến từ chi Hedyotis ...................................... 9 Bảng 1.6. Hoạt tính gây độc tế bào của chi Hedyotis ............................................... 10 Bảng 1.7. Hoạt tính chống oxy hóa và bảo vệ gan của chi Hedyotis. ...................... 12 Bảng 1.8. Hoạt tính kháng vi sinh vật của chi Hedyotis .......................................... 13 Bảng 1.9. Hoạt tính giảm đau, kháng viêm của chi Hedyotis .................................. 14 Bảng 3.1. Số liệu phổ NMR của hợp chất HP1 và hợp chất tham khảo .................. 28 Bảng 3.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất HP2 và hợp chất tham khảo .................. 31 Bảng 3.3. Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất phân lập đƣợc ...... 32 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Thế kỉ 21 là thế kỉ sinh học và công nghệ sinh học [37]. Dƣợc liệu là tài nguyên vô cùng quý giá đối với nền y học thế giới. Bên cạnh công tác điều tra, thống kê các loài cây có tác dụng làm thuốc, các nhà khoa học đã đi sâu tìm hiểu, nghiên cứu thành phần hóa học cũng nhƣ hoạt tính sinh học của nó. Do đó, việc nghiên cứu chiết xuất các chất có hoạt tính dƣợc học từ thực vật đang trở thành trọng điểm trong nền y dƣợc học hiện đại của nhiều quốc gia trên thế giới. Cùng với sự đi lên của nền công nghiệp hóa - hiện đại hóa, thế giới đang phải đối mặt với nhiều cuộc chiến nhƣ bệnh tật, khủng bố, ô nhiễm môi trƣờng, thiên tai. Trong đó, cuộc chiến chống nhiễm trùng đã và đang đặt nặng cho nền y tế. Các bệnh truyền nhiễm là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu ở cả trẻ em, thanh thiếu niên và ngƣời lớn, chiếm 16% nguyên nhân các ca tử vong mỗi năm. Hầu hết các trƣờng hợp tử vong là ở các nƣớc thu nhập thấp và thu nhập trung bình [73]. Từ năm 1945, với sự ra đời kháng sinh penicillin đầu tiên và tiếp sau đó là kỷ nguyên của kháng sinh với hàng loạt kháng sinh mới ra đời đã cứu sống hàng triệu bệnh nhân [62]. Tuy nhiên, một trong những vấn đề nan giải đối với thuốc kháng sinh tân dƣợc hiện nay là hiện tƣợng quen thuốc, kháng thuốc và loạn khuẩn do tình hình lạm dụng kháng sinh trong điều trị ngày càng phát triển ở nhiều nƣớc trên thế giới. Đấy là chƣa kể những tai biến nguy hiểm do nhiều loại kháng sinh gây ra, có khi dẫn đến tử vong. Chính vì vậy, gần đây, ngƣời ta nhắc nhiều đến kháng sinh thực vật và có xu hƣớng trở lại với các cây thuốc, sử dụng các kháng sinh tự nhiên của cây cỏ. Trong quá trình tìm kiếm và sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn của 207 dịch chiết các cây thuốc ở miền Trung Việt Nam. Kết quả thu đƣợc cho thấy, cây An điền nón – Hedyotis pilulifera thuộc chi Hedyotis là mẫu có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất và theo điều tra loài này đƣợc ngƣời dân ở vùng Bảo tồn Khe Trăn - Thừa Thiên Huế sử dụng làm thuốc chữa các bệnh về đƣờng tiêu hóa và đau nhức xƣơng khớp [18]. Ngoài ra, còn đƣợc ngƣời dân đồng bào Dao ở huyện Đồng Hỷ, 2 tỉnh Thái Nguyên dùng trị đái dắt, đái buốt, viêm họng sƣng amidan [8]. Tuy nhiên, cho đến nay chƣa có nghiên cứu chính thức nào đƣợc công bố về thành phần hóa học của cây này ở Việt Nam cũng nhƣ trên thế giới. Vì thế, chúng tôi lựa chọn cây An điền nón làm đối tƣợng nghiên cứu của luận văn này với mong muốn có những hiểu biết về mặt hóa học của cây Hedyotis pilulifera, làm tăng giá trị ứng dụng của cây vào thực tế cuộc sống cũng nhƣ góp phần làm phong phú hơn những hiểu biết về các cây thuộc chi Hedyotis. Đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn n-hexan của cây An điền nón Hedyotis pilulifera (Pit.) T.N.Ninh – Rubiaceae” đƣợc tiến hành với hai mục tiêu sau: 1. Chiết tách phân lập một số hợp chất tinh khiết từ phân đoạn n-hexan. 2. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được. 3 Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1. GIỚI THIỆU VỀ HỌ CÀ PHÊ (RUBIACEAE) Họ Cà phê (Rubiaceae) là một họ lớn và đa dạng. Cây gỗ, bụi cây cỏ hoặc dây leo. Lá đơn, nguyên, mọc đối, có lá kèm, lá kèm có khi dính lại với nhau và lớn nhƣ phiến lá, trông nhƣ có 4 hoặc 8 lá vòng. Hoa mọc đơn độc hoặc tụ họp thành xim hay dạng đầu. Hoa đều, lƣỡng tính, mẫu 4-5. Đài 4-5, ít phát triển, dính với bầu. Tràng 4-5, dính nhau, tiền khai hoa van, lợp hay vặn. Nhị nằm xen kẽ với các thùy của tràng và dính vào ống hay họng của tràng. Bộ nhụy gồm 2 noãn dính nhau thành bầu dƣới với 2 hoặc nhiều ô, mỗi ô có 1 đến nhiều noãn. Quả nang, quả mọng hay quả hạch. Hạt có phôi nhỏ nằm trong nội nhũ [6]. Phân bố: Trên thế giới có 450 chi với 7000 loài, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, ở Việt Nam có trên 90 chi [2], [6]. 1.2. GIỚI THIỆU VỀ CHI AN ĐIỀN (HEDYOTIS L.) 1.2.1. Đặc điểm thực vật và phân bố Chi Hedyotis là một chi lớn trong họ Cà phê (Rubiaceae). Trên thế giới chi này đã đƣợc ghi nhận có khoảng 500 loài, phân bố rộng ở khu vực cận nhiệt đới và nhiệt đới, chủ yếu ở châu Phi và châu Á, thƣờng mọc ở trong rừng, ven rừng nơi đất ẩm, từ vùng núi cao đến vùng đất cát ven biển [21]. Các loài thuộc chi Hedyotis thƣờng có thân thảo hơi vuông, cao từ 30-85 cm. Lá nhỏ, phiến lá hẹp, có gân giữa, gân phụ không nổi rõ. Hoa màu trắng hay vàng, mọc thành từng cụm ở nách lá hay đỉnh nhánh [7]. Theo Phạm Hoàng Hộ, chi An điền nƣớc ta có khoảng 70 loài, chia làm 7 thứ, phân bố rải rác khắp cả nƣớc [7]: H. ovatifolia (An điền lá xoan), H. oligocephala, H. pachycarpa, H. corymbosa (Cóc mẵn), H. diffusa (An điền lan), H. herbacea (An điền cỏ), H. heynii (An điền lữ đồng), H. arguta (An điền tinh), H. labialis (An điền môi), H. biflora (An điền hai hoa), H. precox (An điền sớm), H. contracta (An điền ngắn), H. valerianelloides, H. crassiflolia (An điền lá dày), H. dichotoma (An điền lƣỡng 4 phân), H. justiciformis (An điền xuân tiết), H. glabra (An điền không lông), H. lineata (An điền lằn), H. pierrei (An điền pierre), H. chereevensis (An điền cheo- reo), H. racemose (An điền chúm), H. scandens (An điền leo), H. elegans (An điền thanh), H. scoparia (An điền chổi), H. chevalierii (An điền Chevalier), H. ternate (An điền chụm ba), H. tetrangularis (An điền bốn cạnh), H. wallichii (An điền wallichii), H. havilandii (An điền Haviland), H. effuse (An điền tràn), H. ampliflora (An điền hoa rộng), H. umbellata (An điền tán), H. capitellata (An điền đầu), H. macrosepala, H. simplicissima (An điền đơn giản), H. pterita (An điền cánh), H. hedyotidea, H. krewanhensis (An điền Krewanh), H. lecomtei (An điền Lecomte), H. petelotii (An điền Pếtlot), H. rudis (An điền nhám), H. brachiate (An điền nhánh), H. vestita (An điền áo), H. auricularia (An điền tai), H. fraternal, H. grandis, H. hispida (An điền phún), H. acutangula (An điền cạnh nhọn), H. hirsutula (An điền phún), H. leptoneura (An điền gân mảnh), H. lindleyana (An điền lindley), H. capitellata var. mollis (Dạ cẩm), H. nigrescens (An điền đen), H. philippinensis(An điền Philippin), H. tonkinensis (An điền Bắc bộ), H. pinifolia (An điền lá thông), H. merguensis (Răm núi), H. microcephala (An điền đầu nhỏ), H. mouretii (An điền mouret), H. quocensis (An điền Phú Quốc), H. ovata (An điền trứng), H. pressa (An điền sát), H. symplociformis (An điền dung), H. multiglomerulata (An điền nhiều chụm), H. equisetiformus, H. trinervia (An điền ba gân), H. pruinosa, H. bracteata, H. tenelliflora (An điền hoa nhỏ), H. uncinella var. mekonggensis (An điền Cửu Long). 1.2.2. Thành phần hóa học Nghiên cứu đầu tiên về chi Hedyotis đƣợc công bố năm 1933 ở Ấn Độ bởi Dey và Lakshminarayan [51]. Qua các tài liệu thu thập đƣợc cho thấy thành phần hóa học của chi Hedyotis gồm có các nhóm chất: alkaloid, flavonoid, antraquinone, saponin và sterol, iridoid và lignan. 1.2.2.1. Lớp chất alkaloid Một số alkaloid đã đƣợc phân lập từ một số loài Hedyotis nhƣ: H. auricularia, H. chrysotrica, H. capitellata và H. capitellata var. mollis. 5 Bảng 1.1. Một số alkaloid tiêu biểu đƣợc phân lập từ chi Hedyotis Alkaloid Loài Bộ phận Hợp chất TLTK Bis-indole H. auricularia Rễ, thân Auricularine (1) [51] β-carboline H. chrysotricha Toàn cây Chrysotricine (2a, 2b) [55] H. capitellata Phần trên mặt đất Capitelline (3) Cyclocapitelline (4a) Isocyclocapitelline (4b) [59] H. capitellata var. mollis Phần trên mặt đất Hedyocapitelline (5) Hedyocapitine (6a, 6b) [50] Hình 1.1. Một số alkaloid tiêu biểu đƣợc phân lập từ chi Hedyotis 6 1.2.2.2. Lớp chất flavonoid Flavonoid là một nhóm hợp chất khác đƣợc tìm thấy phong phú trong Họ Cà phê cũng nhƣ trong một số loài thuộc chi Hedyotis. Bảng 1.2. Flavonoid từ chi Hedyotis Loài Flavonoid TLTK H. diffusa - Kaempferol 3-O(2-O-(6-O-E-feruloyl)-β-D- glucopyranosyl)-β-D-galactopyranoside - Kaempferol 3-O(2-O-β-D-glucopyranosyl)-β-D- galactopyranoside - Quercetin - Quercetin 3-O-glucopyranoside - Quercetin 3-O-sambubioside - Quercetin 3-O-sophorosid - Quercetin 3-O-rutinoside - Quercetin 3-O(2-O-β-D-glucopyranosyl)-β-D- galactopyranoside [51] [39] [41] H. herbacea - Kaempferol 3-O-rutinoside - Kaempferol 3-O-glucoside - Kaempferol 3-O-arabinopyranoside - Quercetin 3-O-galactoside [51] H. dichotoma - Isovitexin [15] H. verticillata - Kaempferitrin [25] H. pressa - 3,5,7,4’-tetrahydroxyflavon - 3,5,7,4’-tetrahydroxyflavon-3-O-β-D-glucopyranosid - Amentoflavon [4] 7 1.2.2.3. Lớp chất anthraquinone Bốn anthraquinone đầu tiên đã đƣợc phân lập từ H. diffusa từ năm 1986 [2