Luận văn Phân lập, tuyển chọn một số chủng vi khuẩn cố định đạm Azospirillum trong rễ cây ngô tại một số địa điểm của tỉnh Đắk Nông

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN NGUYỄN TIẾN DŨNG PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM Azospirillum TRONG RỄ CÂY NGÔ TẠI MỘT SỐ ĐỊA ĐIỂM CỦA TỈNH ĐĂK NÔNG LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC BUÔN MA THUỘT, NĂM 2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN NGUYỄN TIẾN DŨNG PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM Azospirillum TRONG RỄ CÂY NGÔ TẠI MỘT SỐ ĐỊA ĐIỂM CỦA TỈNH ĐĂK NÔNG Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 604230 LUẬN VĂN THẠC SĨ: Sinh học Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Anh Dũng BUÔN MA THUỘT, NĂM 2011 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ một công trình nào khác. Người cam đoan Nguyễn Tiến Dũng ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn tất khóa luận này, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới: Trường Đại học Tây Nguyên, các Phòng ban và Khoa chức năng đã tổ chức đào tạo, quản lý và tạo điều kiện thuận cho tôi hoàn tất khóa học và luận văn. Các thầy, cô giáo trong và ngoài trường đã nhiệt tình giảng dạy và cung cấp những kiến thức quý báu trong suốt khóa học. PGS. TS Nguyễn Anh Dũng, người quan tâm, nhiệt tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành khóa luận. PGS. TS Nguyễn Hữu Hiệp thuộc viện nghiên cứu và phát triển Công Nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ đã có những trao đổi quý báu và tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành khóa luận. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Bộ môn Sinh học thực vật, Bộ môn SHTN, Bộ môn khoa học đất, Trại thực nghiệm Khoa Nông Lâm và Phòng thí nghiệm CNSH&MT là các đơn vị đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi thực hiện và hoàn tất khóa luận. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tập thể cán bộ, giáo viên trường THCS Tô Hiệu, huyện Krông Ana, tỉnh Đăklăk đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi thực hiện và hoàn tất khóa luận. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tập thể lớp Cao học Sinh học thực nghiệm K03 đã cùng tôi san sẻ những buồn vui, cùng tôi học tập và trao đổi kiến thức trong suốt khóa học. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới em Nguyễn Xuân Tài lớp Khoa học cây trồng K2007, em Lê Thị Hương lớp Cử nhân Sinh K2007 đã cùng tôi tham gia nghiên cứu đề tài. Đặc biệt, xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới những người thân trong gia đình đã luôn quan tâm, tin tưởng, động viên tôi trong suốt quá trình học cũng như thực hiện luận văn. Buôn Ma Thuột, tháng 09 năm 2011 Nguyễn Tiến Dũng iii MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1 1. Tính cấp thiết của đề tài .................................................................................. 1 2. Mục tiêu của đề tài ......................................................................................... 2 3. Ý nghĩa của đề tài ........................................................................................... 2 PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 3 1.1 Giới thiệu về cây ngô .................................................................................... 3 1.1.1 Phân loại thực vật ...................................................................................... 3 1.1.2 Đặc điểm hình thái cây ngô ....................................................................... 3 1.1.3 Yêu cầu sinh thái của cây ngô ................................................................... 4 1.1.3.1 Yêu cầu nhiệt độ ..................................................................................... 4 1.1.3.2 Yêu cầu về ánh sáng ............................................................................... 4 1.1.3.3 Yêu cầu về nước ..................................................................................... 5 1.1.3.4 Yêu cầu về đất ........................................................................................ 5 1.1.3.5 Yêu cầu chế độ không khí trong đất ........................................................ 5 1.1.4 Vai trò các chất dinh dưỡng với cây ngô ................................................... 6 1.1.4.1 Vai trò của đạm ...................................................................................... 6 1.1.4.2 Vai trò của lân ........................................................................................ 6 1.1.4.3 Vai trò của kali ....................................................................................... 6 1.1.4.4 Vai trò các nguyên tố vi lượng ................................................................ 7 1.2 Tổng quan về vi khuẩn cố định Nitơ (N) ....................................................... 7 1.2.1 Vi khuẩn cố định N tự do ........................................................................... 7 1.2.1.1 Vi khuẩn cố định N tự do hiếu khí .......................................................... 7 1.2.1.2 Vi khuẩn cố định N tự do kỵ khí Clostridium ......................................... 9 1.2.2 Vi khuẩn cố định N cộng sinh .................................................................... 9 1.2.2.1 Các vi khuẩn sống cộng sinh với cây họ Đậu .......................................... 9 1.2.2.2 Các vi khuẩn sống cộng sinh với cây không thuộc họ Đậu .................... 10 iv 1.3 Tình hình nghiên cứu ngoài nuớc................................................................ 13 1.4 Nghiên cứu trong nước ............................................................................... 15 PHẦN II. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 17 2.1 Nội dung nghiên cứu .................................................................................. 17 2.2 Vật liệu và địa điểm nghiên cứu ................................................................. 17 2.2.1 Vật liệu và thiết bị nghiên cứu ................................................................. 17 2.2.2 Địa điểm nghiên cứu ................................................................................ 18 2.2.3 Thời gian nghiên cứu ............................................................................... 18 2.3 Phương pháp nghiên cứu ............................................................................ 18 2.3.1 Phương pháp thu mẫu .............................................................................. 18 2.3.2 Phương pháp phân lập ............................................................................. 18 2.3.3 Phương pháp mô tả đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh học của các chủng Azospirillum ..................................................................................................... 20 2.3.4 Phương pháp xác định khả năng tạo IAA của các chủng Azospirillum ..... 20 2.3.5 Phương pháp tuyển chọn các chủng Azospirillum có khả năng cố định đạm bằng nghiên cứu thử nghiệm trên cây ngô ........................................................ 21 2.3.6 Phương pháp định danh các chủng Azospirillum được tuyển chọn bằng kỹ thuật PCR ......................................................................................................... 23 2.3.7 Phương pháp nghiên cứu xây dựng quy trình nhân sinh khối của các chủng Azospirillum được tuyển chọn .......................................................................... 23 2.3.7.1 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sinh khối của các chủng Azospirillum ...................................................................... 23 2.3.7.2 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh khối của các chủng Azospirillum .............................................................................. 25 2.3.7.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ lắc đến sinh khối của các chủng Azospirillum ........................................................................................... 25 2.3.7.4 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến sinh khối của các chủng Azospirillum ............................................................... 25 v 2.3.7.5 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến sinh khối của các chủng Azospirillum .............................................................................. 25 2.3.8 Phương pháp đánh giá khả năng cố định đạm của các chủng vi khuẩn Azospirillum được tuyển chọn trên đồng ruộng................................................. 26 2.3.9 Phương pháp xử lý số liệu thống kê ......................................................... 28 PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 29 3.1 Phân lập các chủng vi khuẩn Azospirillum trong rễ cây ngô tại một số địa điểm của tỉnh Đăk Nông ................................................................................... 29 3.2 Mô tả đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh học của các chủng Azospirillum .. 30 3.3 Kết quả nghiên cứu xác định khả năng tạo IAA của các chủng Azospirillum ......................................................................................................................... 34 3.4 Kết quả tuyển chọn các chủng Azospirillum có khả năng cố định đạm bằng nghiên cứu thử nghiệm trên cây ngô ................................................................. 37 3.4.1 Ảnh hưởng của các chủng Azospirillum đến sinh trưởng của cây ngô trong bầu đất .............................................................................................................. 37 3.4.2 Ảnh hưởng của các chủng Azospirillum đến hàm lượng đạm trong lá ngô 41 3.4.3 Ảnh hưởng của các chủng Azospirillum đến hàm lượng diệp lục trong lá 43 3.5 Kết quả định danh các chủng Azospirillum được tuyển chọn bằng kỹ thuật PCR .................................................................................................................. 45 3.6 Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân sinh khối của các chủng Azospirillum được tuyển chọn ............................................................................................... 46 3.6.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sinh khối của các chủng Azospirillum ........................................................................................... 46 3.6.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh khối của các chủng Azospirillum ..................................................................................... 47 3.6.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ lắc đến sinh khối của các chủng Azospirillum ..................................................................................................... 49 3.6.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến sinh khối của các chủng Azospirillum .............................................................................. 51 vi 3.6.5 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường nuôi cấy đến sinh khối của các chủng Azospirillum ...................................................................... 53 3.7 Kết quả đánh giá khả năng cố định đạm của các chủng vi khuẩn Azospirillum được tuyển chọn trên đồng ruộng ..................................................................... 55 3.7.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các chủng Azospirillum được tuyển chọn đến sinh trưởng của cây ngô ..................................................................... 55 3.7.1.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các chủng Azospirillum được tuyển chọn đến chiều cao cây ngô .............................................................................. 55 3.7.1.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các chủng Azospirillum được tuyển chọn đến số lá của cây ngô ............................................................................... 58 3.7.1.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các chủng Azospirillum được tuyển chọn đến chiều dài lá cây ngô ........................................................................... 61 3.7.1.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các chủng Azospirillum được tuyển chọn đến đường kính gốc ............................................................................................ 63 3.7.1.5 Kết quả xác định hàm lượng diệp lục trong lá ....................................... 65 3.7.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các chủng Azospirillum được tuyển chọn đến năng suất của cây ngô ........................................................................ 66 PHẦN IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................... 72 4.1 Kết luận ...................................................................................................... 72 4.2 Kiến nghị .................................................................................................... 73 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC vii CÁC CHỮ VIẾT TẮT ABA Abscisic acid BNF Biological nitrogen fixation bp Base pairs Cs Cộng sự Cl Clo DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxyribonucleotide triphotphate ĐC Đối chứng EtBr Ethidium bromide GA Gibberillins IAA Indole - 3 - acetic acid IBA Indole - 3 - butyric acid K2O Kali nguyên chất Mg Magie N Đạm NT Nghiệm thức PCR Polymerase chain reaction PHB Poly hydroxybutyrate P2O5 Lân nguyên chất S Lưu huỳnh VK Vi khuẩn viii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng Azospirillum ................ 30 Bảng 3.2. Kết quả nhuộm gram của các chủng Azospirillum ............................ 33 Bảng 3.3. Giá trị OD530nm đo được ở các nồng độ IAA pha loãng khác nhau .... 34 Bảng 3.4. Kết quả nghiên cứu khả năng tổng hợp IAA của các chủng Azospirillum (mg/l)........................................................................................... 35 Bảng 3.5. Các chỉ tiêu sinh trưởng của cây ngô trồng trong bầu đất .................. 37 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của các chủng Azospirillum đến sinh khối tươi và khô của cây ngô ............................................................................................................. 39 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của các chủng Azospirillum đến hàm lượng N tổng số trong lá ngô. ..................................................................................................... 41 Bảng 3.8. Hàm lượng diệp lục trong lá ngô (mg/g) ........................................... 43 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sinh khối của các chủng Azospirillum ( x 109 tế bào/ml) ......................................................................... 46 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh khối của các chủng Azospirillum ( x 109 tế bào/ml) ......................................................................... 48 Bảng 3.11. Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến sinh khối của các chủng Azospirillum ( x 109 tế bào/ml) ................................................................................................ 50 Bảng 3.12. Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến sinh khối của các chủng Azospirillum ( x 109 tế bào/ml) ......................................................................... 52 Bảng 3.13. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến sinh khối của các chủng Azospirillum ( x 109 tế bào/ml) ......................................................................... 54 Bảng 3.14. Ảnh hưởng của nghiệm thức đến chiều cao cây (cm) ...................... 56 Bảng 3.15. Ảnh hưởng của nghiệm thức đến số lá của cây ngô (lá/cây) ............ 59 Bảng 3.16. Ảnh hưởng của nghiệm thức đến chiều dài lá của cây ngô (cm) ..... 61 Bảng 3.17. Ảnh hưởng của nghiệm thức đến đường kính gốc cây ngô (mm) .... 64 Bảng 3.18. Hàm lượng diệp lục trong lá ngô (mg/g) ......................................... 65 ix Bảng 3.19. Các chỉ tiêu năng suất của cây ngô trồng ngoài đồng ...................... 67 Bảng 3.20. Khối lượng khô 100 hạt và năng suất lý thuyết ............................... 70 x DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ Trang Biểu đồ 3.1. Phương trình đường chuẩn về mối tương quan tuyến tính giữa chỉ số OD530nm và nồng độ IAA (mg/l) ................................................................... 35 Biểu đồ 3.2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sinh khối của các chủng Azospirillum ..................................................................................................... 47 Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh khối của các chủng Azospirillum ..................................................................................................... 49 Biểu đồ 3.4. Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến sinh khối của các chủng Azospirillum ......................................................................................................................... 51 Biểu đồ 3.5. Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến sinh khối của các chủng Azospirillum ........................................................................................... 53 Biểu đồ 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến sinh khối của các chủng Azospirillum..................................................................................................... 55 Biểu đồ 3.7. Hàm lượng diệp lục trong lá (mg/g) .............................................. 66 Biểu đồ 3.8. Ảnh hưởng của các chủng Azospirillum được tuyển chọn đến số hạt/hàng của bắp ngô. ...................................................................................... 68 Biểu đồ 3.9. Ảnh hưởng của các chủng Azospirillum được tuyển chọn đến chiều dài của bắp ngô. ............................................................................................... 69 Biểu đồ 3.10. Ảnh hưởng của các chủng Azospirillum được tuyển chọn đến năng suất lý thuyết. ................................................................................................... 71 xi DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 3.1. Phân lập vi khuẩn từ môi trường bán đặc Nfb ................................... 29 Hình 3.2. Kết quả điện di DNA của các chủng Azospirillum được tuyển chọn .. 45 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Phân vi sinh có nhiều ưu điểm so với phân hóa học, ngoài tác dụng nâng cao năng suất và chất lượng cây trồng, tiết kiệm phân vô cơ, giảm chi phí sản suất thì phân vi sinh còn góp phần quan trọng trong việc bảo vệ môi trường và phát triển nông nghiệp bền vững. Tuy nhiên tình hình sản xuất phân vi sinh ở nước ta vẫn chưa đáp ứng đủ nhu cầu thực tiễn sản xuất của nền nông nghiệp, do quy mô sản xuất nhỏ, chất lượng sản phẩm chưa hoàn thiện và ổn định. Do đó, nghiên cứu để hoàn thiện và nâng cao chất lượng phân vi sinh là việc làm hết sức cần thiết. Trong đó, việc phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật là khâu đầu tiên và quan trọng trong quy trình tạo ra chế phẩm [5]. Hướng đến một nền sản xuất nông nghiệp sinh thái bền vững, trong vài chục năm gần đây ngày càng gia tăng các nghiên cứu vi khuẩn có ích khu trú trong rễ cây trồng không thuộc cây họ đậu, đặc biệt ở cây ngũ cốc. Theo Doebereiner, vi khuẩn Azospirillum ở trong rễ cây không gặp phải sự cạnh tranh nguồn Carbon như vi khuẩn khu trú trên bề mặt rễ và có thể cung cấp đạm cho cây trồng mà không phải nhờ đến khi tế bào chết [35]. Nhóm Azospirillum là vi khuẩn sống trong rễ các loại cây ngũ cốc như lúa, ngô. Nhóm vi khuẩn này có khả năng cố định N, tổng hợp nhiều chất kích thích sinh trưởng thực vật IAA, GA3 góp phần nâng cao độ phì nhiêu của đất, kích thích tăng trưởng, tăng năng suất cây trồng, hạn chế bón phân hóa học và phát triển nền nông nghiệp sinh thái bền vững [35] Ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu, phân lập các chủng vi khuẩn thuộc chi Azospirillum trong rễ lúa. Bên cạnh đó, ngô là một đối tượng có vòng đời sinh trưởng và phát triển tương đối ngắn, ít đầu tư, hiệu quả kinh tế cao, được trồng phổ biến. Tuy nhiên, những nghiên cứu về vi khuẩn cố