Luận văn Tách và xác định β-Lactam trong đối tượng sinh học bằng phương pháp điện di mao quản

MỤC LỤC MỞ ĐẦU………………………………………………………………... 3 CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN…………………………………………...4 1.1. Giới thiệu về chất kháng sinh β-lactam…………………………………………4 1.2. Tình hình lạm dụng kháng sinh ở Việt Nam và trên thế giới hiện nay ……... 8 1.3. Các phương pháp phân tích định lượng β-lactam…………………………….10 1.3.1. Phương pháp quang học ………………………………………………...10 1.3.2. Phương pháp điện hóa …………………………………………………..11 1.3.3. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ……………………………………..11 1.3.4.Phương pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis-CE) ……..13 CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ………16 2.1. Đối tượng và nội dung nghiên cứu …………………………………………….16 2.1.1. Đối tượng ………………………………………………………………..16 2.1.2. Nội dung nghiên cứu ……………………………………………………16 2.2. Giới thiệu chung về phương pháp Điện di mao quản ………………………. 16 2.2.1. Nguyên tắc của phương pháp điện di mao quản……………………… 16 2.2.2. Thiết bị của phương pháp điện di mao quản………………………….. 17 2.2.3 . Các quá trình xẩy ra trong mao quản………………………………… 18 2.2.4. Sự phân loại hay các kiểu (mode) của phương pháp điện di mao quản……………………………………………………………………………...29 2.2.5. Phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC).. 19 2.2.6. Phân tích định lượng trong phương pháp điện di mao quản………….25 2.3. Thực nghiệm…………………………………………………………………… .26 2.3.1. Máy móc và dụng cụ …………………………………………………….26 2.3.2. Hóa chất ………………………………………………………………….26 CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ………………………….28 3.1. Nghiên cứu khảo sát tối ưu điều kiện tách β - Lactam ……………………..28 3.1.1. Chọn bước sóng phát hiện chất …………………………………………28 3.1.2. Mao quản và xử lý mao quản trước khi tách………………………… 29 3.1.3. Chọn phương pháp bơm mẫu …………………………………………..30 3.1.4. Độ điện di và độ điện di hiệu dụng ……………………………………..31 3.1.5. Ảnh hưởng pH của dung dịch đệm điện di …………………………….32 3.1.6. Ảnh hưởng của thành phần dung dịch đệm …………………………...35 3.1.7. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất tạo mixen SDS ……………….36 3.1.8. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đệm…………………………………39 3.1.9. Khảo sát ảnh hưởng thời gian bơm mẫu ………………………………42 3.1.10. Khảo sát ảnh hưởng thế điện di ……………………………………….44 3.1.11. Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ của mao quản …………………………46 3.1.12.Tổng kết điều kiện tối ưu ……………………………………………….49 3.2. Đánh giá phương pháp phân tích ……………………………………………...50 3.2.1. Khảo sát khoảng tuyến tính và lập đường chuẩn ……………………..50 3.2.2 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng của đường chuẩn (LOQ)…………………………………………………………………………... 53 3.2.5. Độ chính xác của phép đo ………………………………………………54 3.2.6. Độ lặp lại của phép đo …………………………………………………..56 3.3. Phân tích mẫu thực ……………………………………………………………..58 3.3.1. Phân tích mẫu thuốc …………………………………………………….58 3.3.2 Phân tích mẫu máu …………………………………………………….. .62 3.4. Ưu nhược điểm của phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) ……………………………………………………………………...63 3.5. Hướng phát triển của đề tài. …………………………………………………...64 PHỤ LỤC ………………………………………………………………..70 MỞ ĐẦU Ngày nay, khi xã hội ngày càng phát triển thì vấn đề sức khỏe của con người ngày càng được chú trọng đặc biệt là các sản phẩm liên quan trực tiếp đến sức khỏe β-Lactam là thuốc kháng sinh tổng hợp quan trọng chữa bệnh cho con người, thú y từ khi chúng được giới thiệu trên thị trường vào năm 1938 và là loại kháng sinh được dùng nhiều nhất hiện nay. Liều lượng và cách dùng kháng sinh không đúng sẽ dễ bị vi khuẩn nhờn thuốc, kháng thuốc, từ đó việc chữa trị bệnh càng khó khăn. Ngoài ra còn gây lãng phí cho người bệnh vì có các bệnh do virut không chữa được bằng kháng sinh nhưng vẫn dùng kháng sinh, gây khó khăn cho việc chuẩn đoán các bệnh và ảnh hưởng sức khỏe của người bệnh. Hàm lượng lớn kháng sinh trong máu gây ra các bệnh về thận, đặc biệt ở người cao tuổi. Vì vậy kiểm soát và phân tích thuốc kháng sinh đối với người bệnh là biện pháp cần thiết để nâng cao hiệu quả sử dụng chúng. Ở Việt Nam đã có rất nhiều công trình nghiên cứu tách và xác định đồng thời các kháng sinh β-Lactam trong các mẫu dược phẩm, sinh học, thực phẩm và môi trường chủ yếu là các công trình phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC. Phương pháp HPLC là phương pháp tách chọn lọc, độ nhạy cao, lượng mẫu bơm ít thời gian phân tích ngắn. Tuy nhiên phương pháp cũng có một số nhược điểm là phải sử dụng một lượng lớn dung môi để rửa cột, giá thành phân tích cao. Ngược lại, phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) lại sử dụng một lượng hóa chất không đáng kể, tiết kiệm chi phí từ 3 – 4 lần, lượng mẫu bơm nhỏ hơn trong HPLC hàng trăm lần, cỡ nl, cho độ tin cậy cao. Tách và xác định đồng thời kháng sinh β-Lactam bằng phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) trong mẫu dược phẩm và sinh học là một hướng nghiên cứu mới, song với ưu điểm của nó thì phương pháp sẽ ngày càng thông dụng được áp dụng nhiều trong phòng thí nghiệm và phân tích mẫu dịch vụ. Vì vậy chúng tôi quyết định chọn đề tài là “ Tách và xác định β-Lactam trong đối tượng sinh học bằng phương pháp điện di mao quản” CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về chất kháng sinh β-lactam [1,2,10,25] Là các kháng sinh mà phân tử chứa vòng β-Lactam. Gồm các nhóm: penicillin, cephalosporin, monobactam, cacbapenem trong đó hai nhóm sử dụng phổ biến và lớn nhất là penicillin và cephalosporin. Các penicillin thu được từ môi trường nuôi cấy nấm Penicilium notatum và Penicillium chryrogenum, bán tổng hợp từ axit 6-amino penicillanic (6APA). Các cephalosporin tự nhiên được phân lập từ môi trường nuôi cấy nấm Cephalosporium acremonium và bán tổng hợp từ axit 7-amino cephalosporinic (7ACA) xuất phát từ các kháng sinh thiên nhiên. Cấu trúc và phân loại: * Các penicillin Các penicillin đều có cấu trúc cơ bản gồm 2 vòng: vòng thiazolidin, vòng β-Lactam
Hình 1.1. Công thức cấu tạo các kháng sinh penicillin Tên gọi chung công thức của các penicillin khi chưa có gốc R là: (2S,5R,6R 3,3-dimethyl-7-oxo-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid Khi thay thế R bằng các gốc khác nhau, những cacbon bất đối có cấu hình 2S, 5R, 6R ta có các penicilin có độ bền, dược động học và phổ kháng khuẩn khác nhau. Với M là gốc cation thường là: K, Na, H. Nhóm kháng sinh penicillin được chia thành 3 nhóm chính với hoạt tính khác nhau. Bảng 1.1. Phân loại và cấu trúc một số penicillin Tên kháng sinh  R  Hoạt tính   Nhóm penicillin tự nhiên  Penicillin G (PENG) Benzathin 
Benzyl  Gồm các Penicillin tự nhiên và dẫn chất.Phổ hẹp: vi khuẩn gram(+). Không kháng β-lactamase   Nhóm penicillin kháng penicilliiase  Oxacillin (OXA) 
6-[(5-methyl-3-phenyl-1,2-oxazole-4-carbonyl)amino]  Là các Penicillin bán tổng hợp. Phổ hẹp như nhóm I. Kháng penicilliiase, không tác động vào vòng β – Lactam được.    Cloxacillin (CLO) 
6-{[3-(2-chlorophenyl )-5-methyl-oxazole-4-carbonyl]amino}    Nhóm penicillin phổ rộng  Ampicillin (AMP) 
6-([(2R)-2-amino-2-phenylacetyl]amino)  Phổ rộng, tác dụng cả khuẩn gram (+) và (-). Không kháng β-lactamase và penicilliiase    Amoxicillin (AMO) 
6-{[(2R)-2-amino-2-(4-hydroxyphenyl)-acetyl]amino}    * Các cephalosporin Các cephalosporin cấu trúc chung gồm 2 vòng: vòng β-Lactam 4 cạnh gắn với 1 dị vòng 6 cạnh, những cacbon bất đối có cấu hình 6R, 7R. Khác nhau bởi các gốc R
Hình 1.2. Công thức cấu tạo các kháng sinh cephalosporin Tên gọi chung của các cephalosporin khi chưa có gốc R là: (6R,7R) 8-oxo-5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylic acid Khi thay đổi các gốc R, những cacbon bất đối có cấu hình 6R, 7R được các cephalosporin có độ bền, tính kháng khuẩn và dược động học khác nhau. Dựa vào khổ kháng khuẩn, chia các cephalosporin thành 4 thế hệ. Các cephalosporin thế hệ trước tác dụng trên vi khuẩn gram dương mạnh hơn, nhưng trên gram âm yếu hơn thế hệ sau. Trong bản luận văn này, chúng tôi chỉ trình bày thế hệ I (CEP) và thế hệ III (CEF) Bảng 1.2. Phân loại và cấu trúc một số cephalosporin Thế hệ  Kháng sinh  R1  R2  R3   I: Phổ tác dụng trung bình, tác dụng mạnh nhất trên vi khuẩn gram (+), yếu nhất trên gram (-). Không bền và dễ bị β-lactamase phá hủy  Cephalexin (CEP) 
 H  -CH3   III: Tác dụng tốt trên vi khuẩn gram (-), trên vi khuẩn gram (+) thì tác dụng kém penicillin và cephalosporin thế hệ I. Bền với β-lactamase  Cefixim (CEF) 
 H  -CH=CH2   Tính chất: Các β-lactam thường ở dạng bột kết tinh màu trắng, dạng axit ít tan trong nước, dạng muối natri và kali dễ tan; tan được trong metanol và một số dung môi hữu cơ phân cực vừa phải. Tan trong dung dịch axit và kiềm loãng do đa phần chứa đồng thời nhóm –COOH và –NH2. Cực đại hấp phụ chủ yếu do nhân phenyl, tùy vào cấu trúc khác làm dạng phổ thay đổi (đỉnh phụ, vai, sự dịch chuyển sang bước sóng ngắn hoặc dài, giảm độ hấp thụ). Các β-lactam là các axit với nhóm –COOH có pKa= 2.5-2.8 tùy vào cấu trúc phân tử. Trong môi trường axit, kiềm, β-lactamase có tác dụng phân cắt khung phân tử, mở vòng β-lactam làm kháng sinh mất tác dụng. Bảng 1.3. Hằng số axit của các kháng sinh nghiên cứu Tên kháng sinh  pKa1  Tên kháng sinh  pKa1  Tên kháng sinh  pKa1   PEN  2.74  AMO  2.8  CLO  2.7   AMP  2.7  CEP  2.6  CEF  2.75   OXA  2.72       Tác dụng: Cơ chế: Các penicillin có khả năng acyl hóa các D- alanin tranpeptidase, làm cho quá trình tổng hợp peptidoglycan không được thực hiện. Sinh tổng hợp vách tế bào bị ngừng lại. Ít tác dụng trên vi khuẩn gram (-). Mặc khác, các penicillin còn hoạt hóa enzym tự phân giải murein hydroxylase làm tăng phân hủy vách tế bào, kết quả là vi khuẩn bị tiêu diệt. Ngăn cản xây dựng và giảm độ bền của mang tế bào vi khuẩn nên chủ yếu kìm hãm sự tồn tại và phát triển của vi khuẩn. Các kháng sinh β-lactam có hoạt phổ rộng. Kháng thuốc: Vi khuẩn sinh ra các β-lactamase, là enzim có tác dụng mở vòng β-lactam, theo phản ứng ái nhân vào nhóm C=O, làm kháng sinh mất tác dụng. Tất cả các cách kháng không sinh ra β-lactamase để thực hiện gọi là kháng gián tiếp (được gọi là kháng methicillin). Độc tính: Các kháng sinh β-lactam độc tính thấp, nhưng cũng dễ gây dị ứng thuốc: dị ứng, mày đay, vàng da, gây độc với thận, rối loạn tiêu hóa…nguy hiểm nhất là sốc phản vệ.. Thuốc không dùng cho trẻ sơ sinh và trong thời kỳ cho con bú. Chống chỉ định dị ứng với thành phần của thuốc. 1.2. Tình hình lạm dụng kháng sinh ở Việt Nam và trên thế giới hiện nay Như trên cho thấy, có nhiều loại kháng sinh khác nhau, tác động bằng các cơ chế khác nhau đối với các vi trùng khác nhau. Kháng sinh chỉ có tác dụng với các bệnh do vi trùng (bacteria), không có tác dụng với các bệnh do siêu vi (virus). Để điều trị bệnh nhiễm trùng cần biết loại vi trùng gây bệnh để chọn kháng sinh thích hợp. Vì thiếu hiểu biết và vì tin tưởng sai lầm, nên ở khắp nơi trên thế giới, nhất là ở các nước đang phát triển, người ta đã dùng kháng sinh quá nhiều, cả khi không cần thiết, không đúng chỉ định và không đúng cách. Năm 2000, các bác sĩ Hoa kỳ viết 160 triệu toa thuốc kháng sinh cho 275 triệu người dân, một nửa đến 2/3 số toa đó được coi là không cần thiết.Theo R. Gonzales [6,26], 3/4 số kháng sinh dùng ở ngoại chẩn là cho viêm đường hô hấp trên trong khi 60% các trường hợp viêm đường hô hấp trên là do siêu vi,  không cần và không điều trị được bằng kháng sinh. Dùng cephalosporins bừa bãi khiến enterococus trở nên đề kháng và cũng đã xuất hiện các vi trùng enterococus kháng vancomycin. Theo báo cáo của A.W. McCormick [13] năm 2003, tỉ lệ pneumococus kháng penicillin tăng nhanh ở Hoa kỳ, tác giả dự tính đến năm 2004, 41% pneumococcus sẽ đề kháng penicillin. Tỉ lệ vi trùng lao kháng thuốc tăng cao khiến phải dùng 4 thứ thuốc kết hợp để điều trị bệnh lao.  Các vi trùng kháng thuốc không khu trú ở một địa phương nào vì với phương tiện giao thông mau lẹ, vi trùng có thể di chuyển đến khắp nơi trên thế giới trong vòng 24 giờ. D.P. Raymond [17] mỗi năm ở Hoa kỳ có 2 triệu người bị nhiễm trùng vì lây lan trong bệnh viện, hơn một nửa số này là do vi trùng kháng thuốc, gây tử vong cho 70 ngàn người và làm tốn của ngân sách từ 5 đến 10 tỉ đô-la Tại Việt Nam, theo báo cáo của Nguyễn Kim Phượng và J. Chalker [4], năm 1997 tại 23 trạm y tế ở Hải phòng, 69% bệnh nhân được cho kháng sinh, 71% bệnh nhân không dùng kháng sinh đúng liều lượng và đúng thời gian (dưới 5 ngày).  Theo [4] Qua thống kê tại khoa Dị ứng - Miễn dịch lâm sàng Bệnh viện Bạch Mai cho thấy, hơn 70% bệnh nhân dị ứng do dùng kháng sinh, trong đó có không ít trẻ em. Sốc phản vệ do dùng kháng sinh là tai biến nghiêm trọng nhất, dễ gây tử vong. Nhiều trường hợp dị ứng thuốc gây giảm hồng cầu, bạch cầu, thiếu máu huyết tán, xuất huyết giảm tiểu cầu, tổn thương tế bào gan... Phó giám đốc Bệnh viện Nhi Trung ương Nguyễn Văn Lộc thừa nhận, tiền mua kháng sinh đang chiếm tới 60% tổng kinh phí mua thuốc của bệnh viện. Nhiều loại kháng sinh gần như đã bị kháng hoàn toàn. Đối với vi khuẩn E.coli (gây bệnh tiêu chảy, viêm phổi, nhiễm trùng huyết), tỉ lệ kháng thuốc ở Ampiciline là 88%, Amoxiciline là 38,9%. Đối với vi khuẩn Klebsiella (gây bệnh nhiễm trùng huyết và viêm phổi), tỉ lệ kháng thuốc của Ampiciline gần 97% và Amoxiciline là 42% Các nhà chuyên môn đã báo động về hậu quả nguy hiểm của sự lạm dụng kháng sinh từ nhiều chục năm nay. Năm 1981, sau hội nghị ở Santa Domingo, các nhà chuyên môn đã thành lập “Liên Hiệp vì sự Sử  Dụng Kháng Sinh Hợp Lý” (Alliance for the Prudent use of Antibiotics) có thành viên thuộc 93 quốc gia nhằm chống lại sự lan tràn của các bệnh do vi trùng kháng thuốc tại các nước đang phát triển.    Năm 2001, Tổ Chức Y Tế Thế Giới đã đề ra “Kế Hoạch Toàn Cầu để Kiểm Soát Sự Đề Kháng Kháng Sinh”. Kế hoạch đề cập đến mọi hoạt động y tế của tất cả các quốc gia đã phát triển cũng như đang phát triển: Phòng thí nghiệm phải tăng cường khả năng chẩn đoán các bệnh nhiễm trùng, giúp chẩn đoán nhanh chóng và chính xác, đo lường độ nhạy của kháng sinh, đo nồng độ kháng sinh trong máu. Ngành dược cần cung cấp đầy đủ thuốc thiết yếu, ngăn ngứa sự lưu hành của các thuốc giả, 5% lượng thuốc lưu hành tại các nước đang phát triển là thuốc giả mạo, không đúng phẩm chất, hàm lượng hoặc không có hoạt chất…… Nếu ngăn ngừa được sự phát triển của các vi trùng kháng thuốc chúng ta sẽ bảo vệ được môi trường sống, duy trì được sự hữu hiêu của kháng sinh, hạn chế được chi phí về y tế và cứu đươc nhiều sinh mạng.  1.3. Các phương pháp phân tích định lượng β-lactam 1.3.1. Phương pháp quang học Phương pháp đo quang là phương pháp phân tích dựa trên tính chất quang học của chất cần phân tích như tính hấp thụ quang, tính phát quang… Các phương pháp này đơn giản, dễ tiến hành, thông dụng, được ứng dụng nhiều khi xác định β-lactam, đặc biệt trong dược phẩm. Các β-lactam hấp thụ UV nhưng không nhiều cực đại hấp thụ, chúng cũng tạo phức với một số ion kim loại giúp nâng cao độ nhạy của phép đo. Trong nhiều trường hợp, các β-lactam được thủy phân thành các chất đơn giản hơn để phân tích. Các phương pháp phát quang có thể dùng xác định các β-lactam với độ nhạy khá cao dựa trên đặc tính tạo phức với ion kim loại hay phản ứng quang hóa của các β-lactam. A. Fernández-González và cộng sự [11] dùng Cu2+ thủy phân và tạo phức với AMP, với bước sóng kích thích 343nm, phát xạ 420nm có giới hạn phát hiện thu được 4.10-7M (0.16 mg/l). Phương pháp này kết hợp phương pháp dòng chảy cho hiệu quả và tốc độ phân tích cao, sử dụng để phân tích AMP trong thuốc uống, huyết thanh… Theo [18], F. Belal và cộng sự xác định AMO và AMP trong thuốc uống bằng phương pháp phổ hấp thụ phân tử. Phương pháp cải tiến sự thủy phân của kháng sinh với HCl 1M, NaOH 1M sau đó thêm PdCl2, KCl 2M. Kết quả tạo ra phức màu vàng được đo tại bước sóng 335 nm. Khoảng tuyến tính từ 8- 40 mg/l và giới hạn phát hiện của AMP là 0.73 mg/l, AMP 0.76 mg/l Wei Liu và cộng sự [28], sử dụng phản ứng quang hóa của β-lactam với hệ luminol-K3Fe(CN)6 kết hợp phương pháp chiết pha rắn mắc trực tiếp đã phân tích một số β-lactam (penicillin, cefradine, cefadroxil, CEP ) trong sữa đạt độ nhạy cao: PEN là 0.5 mg/l, cefradine 0.04 mg/l, cefadroxil là 0.08 mg/l, 0.1 mg/l CEP. Kết quả được kiểm chứng lại bằng phương pháp HPLC, detector UV-VIS, nồng độ CEP trong mẫu là 0.1 mg/l. Tuy nhiên, nếu không kết hợp với phương pháp chiết pha rắn mắc nối tiếp, các phương pháp quang học chủ yếu chỉ dùng xác định riêng rẽ từng chất kháng sinh và trong các đối tượng có nhiều yếu tố ảnh hưởng hay chất tương tự chất phân tích, việc xác định sẽ kém chính xác. Ngoài ra, trong nhiều trường hợp chất phân tích cần thủy phân mới phát hiện được cũng là sự hạn chế của phương pháp này. 1.3.2. Phương pháp điện hóa Một số phương pháp điện hóa đã được ứng dụng để phân tích các β-lactam nhưng không phổ biến nhiều. Theo [7], Daniela P. Santos và cộng sự sử dụng sensor điện thế phân tích AMO, đạt giới hạn phát hiện 0.92 μM (0.39 mg/l) trong môi trường đệm axetat 0.1M pH=5.2. 1.3.3. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Trong những năm gần đây, phương pháp HPLC đã đóng một vai trò vô cùng quan trọng trong việc tách và phân tích các chất trong mọi lĩnh vực khác nhau, nhất là trong việc tách và phân tích lượng vết các chất. Phương pháp HPLC với cột tách pha đảo được sử dụng rất rộng rãi để xác định các kháng sinh β-lactam trong các loại mẫu khác nhau do có nhiều ưu thế so với các phương pháp khác vì có độ chính xác, độ nhạy, độ lặp lại cao, khoảng tuyến tính rộng… Detector ghép nối trong máy HPLC cho phép phát hiện sự xuất hiện chất sau khi rửa giải. Hiện nay có rất nhiều loại detector được sử dụng cho mục đích này đã mở rộng khả năng phân tích được rất nhiều loại chất bằng phương pháp HPLC. Đối với phân tích dư lượng, detector khối phổ (MS) là một sự lựa chọn ưu tiên do có thể phát hiện và phân tích chất trong các đối tượng phức tạp. Theo [29], Blanchflower WJ và cộng sự dùng HPLC – MS phân tích penicillin V, PENG, OXA, CLO, dicloxacillin trong thịt, thận và sữa. Điều kiện chạy sắc ký: cột Inertsil ODS2 (4,6 mm×150 mm, 5 μm); pha động: ACN – (C2H5)3N 0,5% (45/55), dùng nafcillin làm nội chuẩn đạt giới hạn phát hiện trong sữa 2-10 μg/kg, trong thịt 25-100 μg/kg. J.M. Cha và cộng sự [19] dùng phương pháp HPLC – MS để phân tích β-lactam trong nước sông và nước thải. Điều kiện chạy sắc ký: cột Xterra MS C18 (2.1 mm×50 mm, 2.5 μm); pha động: A = axit focmic 0,1%, B = Metanol (MeOH), C = Acetonitril (ACN); chạy gradient: bắt đầu A/B/C=90:5:5(v/v/v), 8 phút A/B/C=50:40:10, 20 phút A/B/C=90:5:5; tốc độ pha động 0.25 ml/phút; nhiệt độ cột 450C; thời gian 20 phút. Áp dụng phân tích AMO, AMP, oxacillin, CLO, cephapirin có giới hạn phát hiện của phương pháp là 8 – 10 ng/l với nước bề mặt, 13 – 18 ng/l với nước thải trước xử lý, 8 – 15 ng/l với nước thải sau xử lý. Một detector quan trọng trong phương pháp HPLC là detector huỳnh quang, với ưu điểm tăng độ nhạy, độ chọn lọc cao. Như trong [16] C.Y.W Yang và cộng sự dùng cột Spherisorb ODS2 (250 mm x 4,6 mm, 5 μm) phân tích AMO trong sữa bò (pha động: ACN/đệm photphat 10mM pH 5.6 – 24/76; detector huỳnh quang: 346 nm – 422 nm) đạt giới hạn phát hiện lần lượt 0.5 μg/kg và 0.3 μg/kg. Tuy vậy, do các β-lactam ít tạo phức phát huỳnh quang và cơ chế phát quang dựa trên phản ứng quang hóa [24, 16] nên chỉ áp dụng với số ít chất hoặc phân tích riêng từng chất chứ không áp dụng phân tích đồng thời nhiều kháng sinh cùng lúc được. Tác giả Ngô Quang Trung [5] đã xây dựng quy trình phân tích đồng thời 6 kháng sinh β_Lactam gồm: AMO, CEP, AMP, CLO, CEF, PENG trong nước thải bệnh viện tại khu vực Hà Nội. Tác giả sử dụng cột tách Supelcosil ODS 250 mm x 4.6 mm, 5 µm, pha động gồm đệm axetat 12 mM pH 4, 70%; ACN 20%, MeOH 10%. Detector UV-VIS đo ở bước sóng 212 nm. Xây dựng đường chuẩn các kháng sinh trong khoảng 0.1 – 1 mg/l, hệ số tương quan R > 99.8%. Giới hạn phát hiện LOD và LOQ là 0.4 và 0.1 mg/l Ngoài ra, còn dùng các detector khác như detector điện hóa, detector độ dẫn…