Luận văn Ứng dụng mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn đánh giá ảnh hưởng của β-1,3/1,6-glucan và vitamin c lên độ mẫn cảm đối với virus gây hội chứng đốm trắng (white spot syndrome virus-wssv) của tôm sú (penaeus monodon)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ****0O0**** ĐẶNG TRẦN QUÂN ỨNG DỤNG MÔ HÌNH GÂY NHIỄM THỰC NGHIỆM CHUẨN ĐÁNH GIÁ ẢNH HƢỞNG CỦA β-1,3/1,6-GLUCAN VÀ VITAMIN C LÊN ĐỘ MẪN CẢM ĐỐI VỚI VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỐM TRẮNG (White spot syndrome virus-WSSV) CỦA TÔM SÚ (Penaeus monodon) LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh -Tháng 9/2006- BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ****0O0**** ỨNG DỤNG MÔ HÌNH GÂY NHIỄM THỰC NGHIỆM CHUẨN ĐÁNH GIÁ ẢNH HƢỞNG CỦA β-1,3/1,6-GLUCAN VÀ VITAMIN C LÊN ĐỘ MẪN CẢM ĐỐI VỚI VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỐM TRẮNG (White spot syndrome virus-WSSV) CỦA TÔM SÚ (Penaeus monodon) LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện TS. NGUYỄN VĂN HẢO ĐẶNG TRẦN QUÂN ThS. NGÔ XUÂN TUYẾN KHÓA: 2002 – 2006 Thành phố Hồ Chí Minh -Tháng 9/2006- MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC FACULTY OF BIOTECHNOLOGY  APPLICATION OF STANDARDIZIED CHALLENGE MODEL TO TEST THE EFFICACY OF β-1,3/1,6-GLUCAN AND VITAMIN C ON THE SUCCEPTIBILITY OF BLACK TIGER SHRIMP (Penaeus monodon) TO WHITE SPOT SYNDROME VIRUS (WSSV) GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Professor Student Dr. NGUYEN VAN HAO DANG TRAN QUAN MSc. NGO XUAN TUYEN TERM: 2002 - 2006 HCMC, 09/2006 iv LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành cám ơn quý thầy cô trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh đã truyền đạt cho tôi kiến thức trong những năm học vừa qua. Để hoàn thành đề tài tốt nghiệp này, tôi đã nhận sự giúp rất nhiều từ các thầy cô và các anh chị công tác ở Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II. Trong đó tôi xin chân thành cảm ơn: - TS. Nguyễn Văn Hảo đã tận tình giải đáp những vƣớng mắc trong quá trình thực tập, giúp tôi hoàn thành tốt đề tài tốt nghiệp. - ThS. Ngô Xuân Tuyến là ngƣời đã trực tiếp hƣớng dẫn về phƣơng pháp nghiên cứu, tài liệu khoa học, giúp tôi hoàn thành tốt đề tài tốt nghiệp. - Kỹ sƣ Phạm Thị Tuyết Anh đã tận tình hƣớng dẫn tôi về mặt thao tác trong phòng thí nghiệm, giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực tập. - Các anh chị ở phòng Mô, các anh chị ở trại thực nghiệm Thủ Đức đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực tập vừa qua. Cuối cùng là cảm ơn các bạn lớp Công nghệ sinh học 28 thân mến đã cùng tôi đồng hành trên suốt chặng đƣờng đại học. Tp.Hồ Chí Minh, ngày…tháng…năm 2006 Sinh viên Đặng Trần Quân v TÓM TẮT Trong công nghệ nuôi tôm hiện nay, đặc biệt là các mô hình nuôi tôm mật độ cao, việc áp dụng các giải pháp, phƣơng thức quản lý nhằm tăng cƣờng hiệu quả sản xuất đóng góp đáng kể vào năng suất nuôi. Giải pháp quản lý sử sụng các sản phẩm sinh học tăng cƣờng sức khỏe cho tôm thông qua việc tăng cƣờng hiệu quả đáp ứng miễn dịch của tôm với mầm bệnh, nhất là với mầm bệnh virus, đƣợc xem là giải pháp khá quan trọng. Trong thí nghiệm này, chúng tôi đánh giá sự thay đổi tính mẫn cảm của tôm sú tiền trƣởng thành Penaeus monodon đối với virus đốm trắng (WSSV) sau khi ứng dụng các giải pháp bổ sung các chất kích thích miễn dịch, vitamin C và β- 1,3/1,6-glucan vào thức ăn nuôi tôm trong khoảng thời gian nhất định. Sử dụng mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn đƣợc xây dựng bởi Phòng thí nghiệm virus - Đại học Gent, Vƣơng Quốc Bỉ, kỹ thuật xét nghiệm hóa mô miễn dịch và phƣơng pháp tiêm mô dịch gốc virus đốm trắng dòng Việt Nam (WSSV-VN) đã đƣợc tinh sạch và xác định độc lực thông qua chuẩn độ để xác định sự thay đổi độ mẫn cảm đối với virus của tôm. Thí nghiệm đƣợc tiến hành với hai liều tiêm cao và thấp của độ chuẩn SID50 của dịch gốc WSSV-VN cho tôm sú tiền trƣởng thành sau khi đã nuôi với 3 nghiệm thức thức ăn có bổ sung β-1,3/1,6-glucan (10g/kg thức ăn), bổ sung vitamin C (5g/kg thức ăn) và không bổ sung trong thời gian 15 ngày. Gây nhiễm thực nghiệm cho tôm ở liều thấp (101,5SID50) và liều cao (10 4 SID50) của dịch virus WSSV-VN cho 3 nhóm tôm thuộc 3 nghiệm thức trên. Thu mẫu tôm ở các thời điểm khác nhau sau gây nhiễm: 0, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 108, 120 giờ, để khảo sát sự thay đổi độ mẫn cảm thông qua đánh giá sự biến đổi tình trạng sức khỏe tôm và tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV trên tôm giữa các nghiệm thức. Kết quả thu đƣợc ở thí nghiệm gây nhiễm với liều thấp, tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV của tôm ở 3 nghiệm thức β-1,3/1,6-glucan, vitamin C và đối chứng lần lƣợt là 4,12, 3,49 và 4,94%. Sự khác biệt về tỷ lệ tế bào nhiễm giữa 3 nghiệm thức này không có ý nghĩa (P>0,05). Các dấu hiệu lâm sàng của bệnh đốm trắng xuất hiện sớm hơn ở nghiệm thức đối chứng so với 2 nghiệm thức còn lại. Chƣa thấy rõ sự khác biệt giữa nghiệm thức β-1,3/1,6-glucan và vitamin C. Thí nghiệm gây nhiễm với liều cao, tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV của tôm ở 3 nghiệm thức β-1,3/1,6- glucan, vitamin C và đối chứng lần lƣợt là 3,04, 3,69 và 4,49%. Chỉ có sự khác biệt có ý nghĩa (P<0,05) về tỷ lệ này giữa nghiệm thức đối chứng với β-1,3/1,6-glucan. Các vi dấu hiệu lâm sàng của bệnh đốm trắng xuất hiện sớm hơn ở nghiệm thức đối chứng so với 2 nghiệm thức còn lại. β-1,3/1,6-glucan thể hiện rõ tác dụng làm giảm độ mẫn cảm với WSSV của tôm sú. Trong từng phƣơng thức quản lý, tỷ lệ tế bào nhiễm ở 2 liều tiêm không có sự khác biệt (P>0,05). Ở nhóm tiêm với liều cao, các dấu hiệu lâm sàng của bệnh đốm trắng đến sớm hơn nhóm tiêm liều thấp. vii MỤC LỤC Trang tựa .................................................................................................................... i Lời cảm ơn ............................................................................................................... iii Tóm tắt ..................................................................................................................... iv Mục lục .................................................................................................................... vi Danh sách các chữ viết tắt ...................................................................................... vii Danh sách các bảng ................................................................................................. ix Danh sách các hình ................................................................................................... x PHẦN 1. MỞ ĐẦU .................................................................................................. 1 1.1 Đặt vấn đề ..................................................................................................... 1 1.2 Nội dung ........................................................................................................ 1 1.3 Mục tiêu ........................................................................................................ 2 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................... 3 2.1 Hệ miễn dịch của tôm sú ............................................................................... 3 2.2 Bệnh đốm trắng trên tôm sú .......................................................................... 5 2.2.1 Lịch sử và phân bố bệnh đốm trắng ..................................................... 5 2.2.2 Tác nhân gây bệnh ................................................................................ 5 2.2.3 Dấu hiệu bệnh lý ................................................................................... 6 2.2.4 Phƣơng thức lan truyền ........................................................................ 6 2.3 Các phƣơng thức quản lý nhằm tăng cƣờng sức chịu đựng của tôm đối với bệnh đốm trắng ......................................................................................................... 7 2.3.1 Chất kích thích miễn dịch ..................................................................... 7 2.3.2 Vaccin ................................................................................................. 10 2.3.3 Vitamin ............................................................................................... 11 2.3.4 Fucoidan ............................................................................................. 12 2.4 Mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn WSSV trên tôm ........................... 13 2.4.1 Sơ lƣợc về mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn ........................... 13 2.4.2 Ứng dụng của mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn ...................... 14 2.5 Sơ lƣợc về hóa mô miễn dịch ..................................................................... 15 2.5.1 Nguyên lý ........................................................................................... 15 2.5.2 Các phƣơng pháp nhuộm .................................................................... 15 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIỆN CỨU ................................ 16 3.1 Thời gian và địa điểm ................................................................................. 16 3.2 Vật liệu nghiên cứu ..................................................................................... 16 3.2.1 Vật liệu sinh học ................................................................................. 16 3.2.2 Dụng cụ và hóa chất ........................................................................... 16 3.2.2.1 Dụng cụ ................................................................................... 16 3.2.2.2 Hoa chất .................................................................................. 17 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................ 19 3.3.1 Phƣơng pháp pha loãng dịch huyền phù virus ................................... 19 3.3.2 Phƣơng pháp gây nhiễm WSSV trên tôm sú ...................................... 19 3.3.3 Phƣơng pháp thu mẫu cho IHC .......................................................... 19 3.3.4 Phƣơng pháp xác định WSSV trên tôm bằng kỹ thuật IHC ............... 19 3.3.5 Phƣơng pháp tính tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV (%) trên tôm thí nghiệm20 3.3.6 Phƣơng pháp đo một số yếu tố môi trƣờng nƣớc ............................... 20 3.3.7 Phƣơng pháp xử lý số liệu .................................................................. 20 viii 3.4 Bố trí thí nghiệm ......................................................................................... 21 3.4.1 Chuẩn bị vật liệu cho thí nghiệm gây nhiễm chuẩn ........................... 21 3.4.2 Bố trí thí nghiệm gây nhiễm chuẩn cho tôm với dịch virus WSSV-VN đã chuẩn độ (105,2SID50/ml) ....................................................................... 21 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 23 4.1 Đáng giá vật liệu phục vụ cho thí nghiệm gây nhiễm chuẩn ...................... 23 4.2 Khảo sát ảnh hƣởng của các phƣơng thức quản lý khác nhau lên độ mẫn cảm của tôm đối với WSSV .............................................................................. 24 4.2.1 Kết quả ở thí nghiệm gây nhiễm trên tôm sú với liều thấp (10 1,5 SID50/ml) ............................................................................................ 24 4.2.2 Kết quả ở thí nghiệm gây nhiễm trên tôm sú với liều cao (10 1,5 SID50/ml) ............................................................................................ 28 4.2.3 Kết quả so sánh độ mẫn cảm với 2 liều gây nhiễm của tôm ở từng phƣơng thức quản lý ........................................................................ 32 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................... 35 5.1 Kết luận ....................................................................................................... 35 5.2 Đề nghị ........................................................................................................ 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................. …37 ix DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT WSD: White spot disease. WSSV: White spot syndrome Virus. WSSV-VN: White spot syndrome virus Vietnam IHC: Immunohistochemistry. proPO: prophenoloxidase LPS: Lipopolysaccharide BGBP: Beta-glucan biding protein VP19: envelope protein (19 kDa). VP28: envelope protein (28 kDa). DNA: Deoxiribonucleotide acid. RNA: Ribonucleotide acid. MBV: Monodon Baculovirus YHV: Yellow Head Vius. IHHNV: Infectious hypodermal hemotopoietic necrosis virus. PCR: Polymerase chain reaction. PAP: peroxidase anti peroxidase ABC: avidin-biotin complex LSAB: labelled streptavidin-biotin BPS: Buffer phosphate saline DAB: 3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride. SID50/ml: Shrimp infectious dose 50% enpoint x DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm nuôi tôm sú với các phƣơng thức quản lý khác nhau ......................................................................................................... 20 Bảng 3.2 Các thời điểm thu mẫu ở mỗi đợt thí nghiệm .................................. 21 Bảng 4.1 Kết quả theo dõi các chỉ tiêu môi trƣờng trong quá trình thí nghiệm ............................................................................................................. 23 Bảng 4.2 Kết quả tăng trọng của tôm sau 15 ngày nuôi ................................. 23 Bảng 4.3 Kết quả theo dõi thực nghiệm dấu hiệu lâm sàng của bệnh đốm trắng sau khi gây nhiễm liều thấp…………………………………………… 24 Bảng 4.4 Kết quả tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV của tôm kiểm tra bằng IHC ở liều thấp ................................................................................................ 25 Bảng 4.5 Kết quả kiểm tra tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV (%) trên tôm bằng IHC theo thời gian thu mẫu ở liều thấp………………………………………26 Bảng 4.6 Kết quả theo dõi thực nghiệm dấu hiệu lâm sàng của bệnh đốm trắng sau khi gây nhiễm liều cao .................................................................... 28 Bảng 4.7 Kết quả tỷ lệ nhiễm WSSV của tôm ở 3 nghiệm thức ở liều cao .... 30 Bảng 4.8 Kết quả kiểm tra tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV trên tôm bằng IHC ở các thời điểm thu mẫu ở liều cao……..………………………………………30 Bảng 4.9 So sánh kết quả theo dõi thực nghiệm và phân tích tỷ lệ cảm nhiễm (IHC) giữa 2 liều tiêm………………………………………………....32 Bảng 4.10 Tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV (%) của tôm ở từng phƣơng thức quản lý đƣợc gây nhiễm với 2 liều tiêm………………………………………………33 xi DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1 Sơ đồ sự kích hoạt của β-glucan và Lipopolysaccharide lên các tế bào máu cùa giáp xác ....................................................................................... 4 Hình 2.2 Virus hội chứng đốm trắng .............................................................. 6 Hình 2.3 Tôm nhiễm WSSV và tế bào nhiễm WSSV ..................................... 6 Hình 2.4 Cấu trúc hóa học của -1,3/1,6-glucan ............................................ 9 Hình 2.5 Cấu trúc hóa học của vitamin C ........................................................ 12 Hình 3.1 Gây nhiễm WSSV cho tôm bằng cách tiêm ..................................... 19 Sơ đồ 3.1 Quy trình tổng quát chẩn đoán IHC ................................................. 20 Hình 3.2 Hình bố trí thí nghiệm cảm nhiễm WSSV cho tôm .......................... 21 Hình 4.1 Bể nuôi tôm với hệ thống lọc tuần hoàn ........................................... 23 Hình 4.2 Hình chụp mẫu mô mang ở tôm đƣợc nhuộm IHC (vật kính 40X) thời điểm 24 giờ sau gây nhiễm WSSV ........................................................... 25 Biểu đồ 4.1 Tỷ lệ nhiễm WSSV (%) của tôm ở liều thấp ................................ 26 Biểu đồ 4.2 Tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV (%) của tôm theo thời gian ở liều thấp ................................................................................................................... 26 Hình 4.3 Tôm đối chứng chết thời điểm 38 giờ sau gây nhiễm WSSV ......... 29 Hình 4.4 Hình chụp mẫu mô mang ở tôm đƣợc nhuộm IHC (vật kính 40X) thời điểm 12 giờ sau gây nhiễm WSSV ở liều cao .......................................... 29 Biểu đồ 4.3 Tỷ lệ nhiễm WSSV (%) của tôm ở liều cao ................................. 30 Biểu đồ 4.4 Tỷ lệ nhiễm WSSV (%) của tôm theo thời gian thu mẫu ở liều cao ..................................................................................................................... 31 Hình 4.5 Tôm đƣợc bổ sung β-1,3/1,6-glucan ở 120 giờ sau gây nhiễm ........ 32 1 PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Từ thực tế phải đối đầu với bệnh đốm trắng (White Spot Disease – WSD) do virus gây hội chứng đốm trắng (White spot syndrome virus – WSSV) gây nhiều thiệt hại nặng nề cho ngành nuôi tôm Việt Nam cũng nhƣ thế giới trong những năm qua, nhiều biện pháp kỹ thuật đã đƣợc nghiên cứu và áp dụng ở hầu hết các giai đoạn của một vụ nuôi tạo nên giải pháp “phòng ngừa tổng hợp” nhằm hạn chế tối đa dịch bệnh đốm trắng xảy ra. Mặc dù vậy, cho đến nay biện pháp hữu hiệu để phòng bệnh đốm trắng trên tôm vẫn còn bỏ ngỏ. Đã có nhiều nghiên cứu về việc sử dụng các vaccine hay chất kích thích miễn dịch (immunostimulants) nhằm nâng cao sức đề kháng của tôm đối với WSSV. Tuy nhiên việc đánh giá một cách chính xác và khoa học hiệu quả của các biện pháp này là rất khó. Thông qua mô hình cảm nhiễm chuẩn, sẽ cho phép chúng ta đánh giá một cách khoa học mức độ ảnh hƣởng của một số giải pháp kỹ thuật ứng dụng trong phòng bệnh đốm trắng trên tôm nuôi, cụ thể là việc sử dụng các chất kích thích tăng cƣờng hệ miễn dịch của tôm. Đi từ cơ sở thực tiễn đó, đƣợc sự phân công của bộ môn Công Nghệ Sinh Học trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh và sự chấp thuận của Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thuỷ Sản II, chúng tôi thực hiện đề tài tốt nghiệp: “Ứng dụng mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn đánh giá ảnh hưởng của các phương thức quản lý khác nhau lên độ mẫn cảm đối với virus gây hội chứng đốm trắng (White spot syndrome virus–WSSV) của tôm sú (Peneaus monodon)”. 1.2 Nội dung Trong đề tài, chúng tôi bổ sung vào thức ăn cho tôm 2 hợp chất là Vitamin C và -1,3/1,6-glucan, đƣợc xem nhƣ là các chất kích thích tăng cƣờng hoạt động của hệ thống miễn dịch không đặc hiệu (insufficient immune system) của tôm, trong điều kiện phòng thí nghiệm. Sau đó gây gây nhiễm các đàn tôm với 2 liều gây nhiễm 101,5SID50 và 104SID50 của dòng WSSV-VN đã đƣợc chuẩn độ trong cùng điều kiện. Thu mẫu và 2 tiến hành kiểm tra sự nhiễm WSSV trên tôm bằng kỹ thuật IHC (Immunohistochemistry). 1.3 Mục tiêu Đánh giá ảnh hƣởng của hai hợp chất vitamin C và -1,3/1,6-glucan lên độ mẫn cảm đối với WSSV của tôm sú. 3 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Hệ miễn dịch của tôm sú Ngành nuôi tôm phát triển, tôm thƣờng đƣợc nuôi với mật độ cao trong môi trƣờng tồn tại nhiều tác nhân gây bệnh. Tuy nhiên ở điều kiện bình thƣờng thì giữa sinh vật (vật chủ), mầm bệnh và môi trƣờng giữ trạng thái cân bằng. Bản thân vật chủ duy trì cho mình tình trạng khoẻ mạnh bằng cách chống lại sự tấn công của các tác nhân gây bệnh. Cơ chế kháng bệnh chủ yếu của tôm sú là miễn dịch không đặc hiệu , điều này có hạn chế so với động vật có xƣơng sống do sự khác biệt tiến hoá biểu hiện ở chỗ không có và không tạo ra đƣợc kháng thể đáp ứng lại kháng nguyên lạ xâm nhập (Văn Thị Hạnh và ctv, 2003). Lớp biểu bì là hàng rào lý hoá hữu hiệu chống lại sự bám dính và xâm nhập của mầm bệnh. Một khi hàng rào này bị hƣ hại, các vi sinh vật đi vào cơ thể, vào máu chúng sẽ gặp những cơ chế phòng vệ bẩm sinh bao gồm các đáp ứng miễn dịch tế bào và thể dịch. Đầu tiên, hệ thống hoạt hoá prophenoloxidase (proPO) đƣợc kích hoạt dẫn đến sự tổng hợp melanin và tạo ra các yếu tố liên quan đến các phản ứng miễn dịch khác nhƣ peroxinectin. Tiếp đến, các tế bào máu tham gia vào việc dọn dẹp các mầm bệnh bằng các cơ chế