Tóm tắt Luận án Nghiên cứu đặc điểm di truyền và tính kháng thuốc của Vibrio cholerae phân lập tại tỉnh Trà Vinh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ NGUYỄN THỊ ĐẤU MSHV: 62031005 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN VÀ TÍNH KHÁNG THUỐC CỦA VIBRIO CHOLERAE PHÂN LẬP TẠI TỈNH TRÀ VINH TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC MÃ NGÀNH: 62 42 01 07 CẦN THƠ, 2015 Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại học Cần Thơ Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Hồ Thị Việt Thu Luận án được bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án cấp Trường tại Đại học Cần Thơ Vàogiờ.., ngàytháng..năm. Có thể tìm luận án tại: Thư viện Quốc gia Trung tâm học liệu trường Đại học Cần Thơ 1 Chương 1: GIỚI THIỆU 1.1 Tính cấp thiết của đề tài Vibrio cholerae là vi khuẩn Gram âm, tác nhân của bệnh dịch tả trên người, gây tiêu chảy cấp tính và mất nước, dịch bệnh xảy ra với các hình thức dịch địa phương và đại dịch. Thế giới đã trải qua 7 đại dịch dịch tả, từ năm 1816 đến năm 1923 đã có 6 vụ đại dịch xảy ra, những đại dịch này đều bắt đầu từ Ấn Ðộ và đều do V. cholerae O1 type sinh học cổ điển gây ra. Đại dịch thứ 7 khác với 6 đại dịch trước, đại dịch này do V. cholerae type sinh học El Tor gây ra và có nguồn gốc từ đảo Celebes của Indonesia năm 1961. Đại dịch này kéo dài nhất và có phạm vi rộng hơn 6 đại dịch trước đó, đến nay còn nhiều nước thông báo những đợt bùng phát dịch tả cũng do nguyên nhân này gây ra (Hayes, 2005). Đồng bằng sông Cửu Long, tính đến 19/8/2010 đã có 4 địa phương gồm: Bến Tre, Tiền Giang, thành phố Cần Thơ và An Giang xuất hiện bệnh nhân mắc bệnh tiêu chảy do vi khuẩn V. cholerae (Nguyễn Hoàng Vũ, 2011). Tỉnh Trà Vinh có vị trí địa lý với nhiều nguy cơ tiềm ẩn bệnh dịch tả vì có bờ biển kéo dài khoảng 65 km và trên địa bàn Trà Vinh có hệ thống sông chính với tổng chiều dài 578 km, trong đó có các sông lớn là sông Hậu, sông Cổ Chiên và sông Măng Thít, vì thế rất dễ cho việc lưu hành vi khuẩn tả từ sông Cổ Chiên giáp với tỉnh Bến Tre, nơi đã từng xảy ra dịch bệnh vào năm 2010. Có nhiều loại kháng sinh sử dụng điều trị bệnh tả đang đề kháng với vi khuẩn này, trong đó có V. cholerae, đây là vấn đề phức tạp trong điều trị bệnh và là mối quan tâm đối với sức khỏe cộng đồng. Nhiễm sắc thể được chứng minh là yếu tố di truyền về gene kháng kháng sinh của vi khuẩn. Việc thu nhận và lây truyền của các gene kháng kháng sinh là do các yếu tố di truyền như plasmid, integrons và transposons (Ghosh et al., 2011). Một trong những yếu tố di truyền được tích hợp và sao chép trên nhiễm sắc thể và được truyền gene kháng kháng sinh giữa các vi khuẩn cùng loài trong môi trường (Burrus et al., 2004). Xuất phát từ những vấn đề trên, nghiên cứu được thực hiện với nội dung: “Nghiên cứu đặc điểm di truyền và tính kháng thuốc của V. cholerae phân lập tại tỉnh Trà Vinh”, từ đó giúp cơ sở y tế có chiến lược sử dụng kháng sinh đúng nhằm làm giảm tỉ lệ tử vong, giảm chi phí trong điều trị bệnh, phù hợp với điều kiện kinh tế trong khu vực. 1.2 Mục tiêu: Xác định tỉ lệ nhiễm và type huyết thanh học của các chủng V. cholerae trên những mẫu phân lập được; xác định đặc tính kháng 2 kháng sinh của các chủng V. cholerae và các kiểu đột biến gene gây kháng thuốc; đánh giá quan hệ di truyền giữa các chủng phân lập với các chủng đã công bố và tính đáp ứng miễn dịch với V. cholerae ở thỏ đã được chủng vaccine đang lưu hành trên thị trường. 1.3 Ý nghĩa của luận án: Xác định các kháng sinh còn nhạy cảm với Vibrio cholerae nhằm giúp cơ sở y tế chọn những loại kháng sinh điều trị bệnh tả có hiệu quả trên người. Kết quả của luận án là cơ sở khoa học cho việc lựa chọn chủng vi khuẩn có đột biến để sản xuất vaccine phòng bệnh tả trên người; cung cấp thông tin giúp cảnh báo về khả năng gây bệnh trên người của các chủng Vibrio spp. trong các nguồn nước, nguồn thực phẩm có nguồn gốc thủy hải sản tại tỉnh Trà Vinh. 1.4 Những điểm mới của luận án Là công trình nghiên cứu đầu tiên ở Đồng bằng sông Cửu Long phân lập được 6 chủng V. cholerae trên các loại mẫu thức ăn từ hải sản và mẫu từ môi trường nước sông và nước ao nuôi tôm; xác định được type huyết thanh học của V. cholerae là Ogawa và Inaba; xác định được sự tương đồng về trình tự nucleotide của các chủng V. cholerae phân lập được với trình tự nucleotide của những chủng V. cholerae ở các nước thuộc vùng Đông Nam Á; xác định được gene kháng tetracycline của V. cholerae phân lập được. Bố cục của luận án Luận án gồm 108 trang (không kể phần phụ lục), chia thành các phần như sau: Chương 1: Giới thiệu (4 trang); Chương 2: Tổng quan tài liệu (42 trang); Chương 3: Nội dung, phương tiện và phương pháp nghiên cứu (18 trang); Chương 4: Kết quả và thảo luận (43 trang); Chương 5: Kết luận và đề nghị (1 trang); Tài liệu tham khảo (16 trang). Luận án có 35 bảng, 40 hình. Tổng tài liệu tham khảo là 180, gồm 09 tài liệu tiếng Việt, 171 tài liệu tiếng Anh và 11 tài liệu tham khảo từ trang Web. Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Lịch sử bệnh do vi khuẩn tả Năm 1816 bệnh xuất hiện tại Châu Âu và Mỹ, đến đầu thế kỷ 20 đã có 6 đại dịch tả lan khắp thế giới. Tiếp đó, đến những năm 60 phạm vi gây bệnh của vi khuẩn tả đã được khoanh vùng và cho đến những năm gần đây bệnh chủ yếu xuất hiện ở Đông Nam Á. Năm 1961 type sinh học El Tor gây dịch tại Philippines và tạo làn sóng thứ bảy. Từ đó trở đi type vi khuẩn 3 này tiếp tục gây những vụ dịch tại châu Á, vùng Trung Đông, châu Phi và một phần Châu Âu (Colwell, 2004). Từ năm 1991, tỉ lệ mắc bệnh tả do vi khuẩn V. cholerae O1 đã xảy ra ở Châu Mỹ La tinh (Levine, 1991; Ries et al., 1992), đến năm 1992 bệnh lại xuất hiện và lây lan nhanh chóng bởi V. cholerae O139 trong khu vực Đông Nam Châu Á (Shimada et al., 1993) và gần đây bệnh lại bùng phát ở châu Phi, do type huyết thanh non-O1, non-O139, đây cũng là nguyên nhân quan trọng gây tiêu chảy (Sharma et al., 1998). Các nghiên cứu về sự tiến hóa phân tử chủng V. cholerae O1 ở Peru từ năm 1991-1995, Ấn Độ, và ở Thái Lan cho thấy rằng V. cholerae O1 đã trải qua những thay đổi về di truyền ở mức tương đối cao. Những thay đổi này rất quan trọng trong việc tìm hiểu về dịch tễ học và sự tiến hóa của V. cholerae (Dalsgaard et al., 1999). Tháng 12 năm 1992 một vụ dịch lớn lại xảy ra ở các nước, vi khuẩn gây bệnh được xác định là V. cholerae O139 Bengal. Về mặt di truyền, O139 Bengal hình thành từ type sinh học El Tor nhưng cấu trúc kháng nguyên của chúng cũng biến đổi. Tất cả ở mọi lứa tuổi trên người (kể cả trong vùng đã có dịch) đều có thể bị nhiễm, vi khuẩn V. cholerae O139 đã gây bệnh ít nhất 11 nước ở Đông Nam Á đến năm 2005 (Garg et al., 2003). Ở Việt Nam bệnh tả là một trong những nguyên nhân quan trọng gây ra tiêu chảy từ những năm 1850. Năm 1885, một đợt bùng phát dịch tả lại xảy ra và đến năm 1910-1930 bệnh tả đã được báo cáo hàng năm (Nguyen, 1962). Đến năm 1964 V. cholerae O1 type sinh học El Tor lại gây bệnh ở miền Nam Việt Nam. Trong lịch sử, phần lớn các đợt dịch bệnh tả đều xuất hiện ở các khu vực ven biển miền Trung và Nam Việt Nam. V. cholerae O1 type sinh học El Tor hiếm khi xuất hiện ở Bắc Việt Nam. Đến năm 1976, bệnh có xảy ra tại thành phố Hải Phòng và tỉnh Quảng Ninh (Dalsgaard et al., 1999). Từ năm 2007 đến năm 2008 và năm 2010, một chủng vi khuẩn V. cholerae O139 được phân lập từ 7 mẫu nước và được đặt tên là V. cholerae O139. Tuy có sự lây lan nhanh chóng của O139 trong khu vực Đông Nam Á nhưng ở Việt Nam, có rất ít thông tin về bệnh tả do O139 gây ra (Dong Tu Nguyen, 2012). 2.2 Phân loại – Đặc điểm vi khuẩn Vibrio cholerae 2.2.1 Phân loại vi khuẩn V. cholerae V. cholerae là vi khuẩn Gram âm gây bệnh tả ở người, thuộc chi Vibrio lớp Gammaproteobacteria. V. cholerae có hai type sinh học chính, đó là type sinh học cổ điển và type sinh học El Tor, và một số nhóm type huyết thanh khác. V. cholerae được phân loại căn cứ trên kháng nguyên O ở 4 phần thân và các nhóm huyết thanh, đến nay người ta đã biết có ít nhất 200 nhóm huyết thanh (Kaper et al., 1995). Trước năm 1992, nhóm O1 là nhóm huyết thanh duy nhất gây ra dịch, từ năm 1992 về sau một nhóm huyết thanh khác là O139 gây ra các đại dịch bùng phát tại Ấn Độ và Bangladesh. Hiện nay, 2 nhóm huyết thanh này là nguyên nhân gây bệnh tả lưu hành và phát thành dịch; những nhóm huyết thanh V. cholerae khác không gây thành dịch được gom chung lại thành nhóm V. cholerae non-O1 và non-O139. V. cholerae O1 còn được phân ra 3 type huyết thanh, Ogawa, Inaba và Hikojima; type thứ 3 này ít gặp, các type huyết thanh này được chia thành 3 loại kháng nguyên (KN): A, B và C. 2.2.2 Đặc điểm hình dạng của Vibrio cholerae Vi khuẩn V. cholerae còn gọi là vi khuẩn tả hay phẩy khuẩn tả, có chiều dài từ 1μm đến 3 μm và chiều ngang từ 0,5 μm đến 0,8 μm (1mm = 1.000 μm). Chúng có 1 sợi chiên mao (flagellum) ở một đầu giúp chúng di chuyển rất nhanh theo hình xoắn ốc loạng choạng. Vi khuẩn tả có 2 loại kháng nguyên chính: kháng nguyên H (flagellar) và kháng nguyên O từ thân vi khuẩn (somatic O antigen). Hình 2.1: Cấu tạo vi khuẩn V. cholerae. (Korinfo, 2000) 2.2.3 Đặc tính di truyền về độc lực của Vibrio cholerae Sự xuất hiện của TCP và độc tố vi khuẩn tả được điều khiển bởi các yếu tố di truyền bao gồm toxR, tcpH, tcpP, và toxT. Tất cả những yếu tố di truyền này hợp lại thành đặc tính có độc lực của V. cholerae, đặc tính này có liên quan đến tính di động, khả năng định vị trong ruột, và sự sản xuất độc tố. Khi V. cholerae được tìm thấy trong phân của bệnh nhân, điều đó cho thấy có sự sao chép di truyền của V. cholerae rất độc và rất dễ lây lan. Quá trình tiến hóa của V. cholerae gây bệnh lý có 2 giai đoạn quan trọng: trước hết, các chủng V. cholerae tiếp nhận phage TCP và biến thành V. cholerae TCP +. Sau khi trở thành TCP+, tức là vi khuẩn có tua, tua sẽ 5 đóng vai trò thụ thể cho phage CTXΦ để cho phage chui vào vi khuẩn, và gắn DNA của nó vào nhiễm sắc thể của V. cholerae theo cơ chế phage tiềm tan (lysogenic). Bản chất của các gene CTX và TCP đều là bacteriophage từ bên ngoài được gắn vào trong nhiễm sắc thể của V. cholerae. V. cholerae vốn là vi khuẩn “hiền” nhưng khi bị các bacteriophage gây nhiễm chúng mới trở thành chủng sinh độc tố và gây bệnh lý. V. cholerae trở thành chủng sinh độc tố (toxicogenic V. cholerae) và gây bệnh khi chúng có tiêm mao giúp vi khuẩn bám vào niêm mạc ruột non. Hình 2.2: Sự hình thành chủng V.cholerae có độc tố (Blake, 1994) 2.2.4 Các yếu tố về độc lực V. cholerae sử dụng hai yếu tố độc lực, độc lực từ tiêm mao/roi (TCP) và độc tố tả CTX. TCP, mã hóa cho các yếu tố gây bệnh, là một loại protein từ tiêm mao (Kirn et al, 2000), TCP cũng rất cần thiết cho sự hình thành khuẩn lạc của V. cholerae định vị trong ruột non của chuột sơ sinh (Taylor et al., 1987) và con người (Herrington et al., 1988). Khi sự hình thành khuẩn lạc trong ruột non thành công, V. cholerae sẽ tiết ra độc tố gây bệnh tả. Các độc tố kích thích các tế bào biểu mô ruột non tiết ra dịch lỏng trong lòng ruột non, từ đó có hiện tượng tiêu chảy mất nước. Do đó, sự đột biến ở roi của một số chủng V. cholerae sẽ ảnh hưởng đến yếu tố độc lực TCP, Hình sau biểu hiện sự biến đổi về roi. 6 a. Chủng vi khuẩn hoang dại; b. Vi khuẩn đột biến gene; c. Vi khuẩn đột biến gene Hình 2.3: Vi khuẩn đột biến roi (Ewen, 2008) Nếu vi khuẩn mang gene đột biến sẽ dẫn đến khiếm khuyết trong việc lắp ráp roi (flagellum). Qua Hình trên, đối với loài hoang dại (Hình 2.3a) không mang gene đột biến nên chiều dài roi dễ dàng nhìn thấy qua hiển vi điện tử; Hình (2.3b) vi khuẩn mang gene flgT đột biến nên không hình thành roi; Hình (2.3c) vi khuẩn có roi ngắn hơn cũng do hiện diện gene đột biến roi fliA. Chương 3: NỘI DUNG, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Nội dung nghiên cứu Phân lập, định danh, tỉ lệ nhiễm vi khuẩn Vibrio spp. trên các loại mẫu tại tỉnh Trà Vinh; định type huyết thanh học vi khuẩn V. cholerae phân lập được; giải trình tự nucleotide vi khuẩn V. cholerae dựa trên gene 16S rDNA; xác định gene kháng kháng sinh vi khuẩn V. cholerae được tuyển chọn; thử nghiệm chủng V. cholerae phân lập được trên thỏ nhằm đánh sự đột biến của V. cholerae và khả năng đáp ứng miễn dịch đối với vaccine hiện hành. Thời gian nghiên cứu từ tháng 10/2012 – 4/2014 tại Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng Đại học Cần Thơ; Bệnh viện đa khoa Trung ương Cần Thơ; Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học Đại học Cần Thơ; Khoa Nông nghiệp – Thuỷ sản trường Đại học Trà Vinh; mẫu gửi giải trình tự tại công ty Macgrogen Hàn Quốc. a. Roi dài c. Roi ngắn b. Không có roi 7 3.2 Phương tiện và phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Phương tiện nghiên cứu 3.2.1.1 Hoá chất, môi trường nuôi cấy vi khuẩn Nước cất, nước muối sinh lý (NaCl 0,9%), thuốc thử Kowacs, cồn 96o, cồn 70o, muối tinh khiết, alkaline saline peptone water (ASPW) với các nồng độ từ 0-10%. Môi trường chuyên chở mẫu bệnh phẩm: Cary- Blair (India); môi trường nuôi cấy: TCBS: Thạch Thiosunfat-Citrat-Bile-muối- Sacaroza (Merck); SNA: Saline Nutrient Agar (Merck); môi trường làm kháng sinh đồ: MHA (Muller Hinton Agar), đĩa giấy tẩm kháng sinh (Nam Khoa, Tp. HCM). Môi trường và hóa chất dùng phân lập vi khuẩn: đĩa giấy oxidase, đĩa giấy ONPG, TSI agar (Saline triple sugar iron agar), ADH (Arginine Dihydrolase), Tryptophan saline (Bộ định danh vi khuẩn Gram âm: IDS 14GNR, Nam Khoa, Tp.HCM). 8 loại đĩa kháng sinh sử dụng: streptomycin (10μg), norfloxacin (10μg), ampicillin (10μg), tetracycline (30μg), azithromycin (30μg), amoxicillin-clavulanic axit (30μg), trimethoprim-sulfamethoxazole (25μg) và vancomycin (30μg); bộ thuốc nhuộm Gram: dung dịch crystal violet; lugol; cồn - aceton; safranin (Germany); kháng huyết thanh định type V. cholerae: Inaba, Ogawa và O139; (Viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh). 3.2.1.2 Hoá chất, sinh phẩm dùng cho phản ứng PCR Xác định vi khuẩn dựa trên đoạn gene 16S rDNA Bảng 3.1: Trình tự nucleotide các cặp mồi trong phản ứng PCR dựa trên gene 16S rDNA. Mồi Trình tự nucleotide của mồi (5'3') Mồi xuôi // Mồi ngược Độ dài (bp) 27F 1492R AGAGTTTGATCCTGGCTC’ TACGGTTACCTTGTTACGACT 1500 ctxA-F ctxA-R CTCAGACGGGATTTGTTAGGCACG TCTATCTCTGTAGCCCCTATTACG 302 O139rfb-F O139rfb-R AGCCTCTTTATTACGGGTGG GTCAAACCCGATCGTAAAGG 449 (1) Weisburg et al., (1991); (2)-(3): Alam et al., (2006) Xác định gene kháng kháng sinh 8 Hoá chất ly trích DNA: Tris-HCl, EDTA, H20; hoá chất PCR: Buffer, MgCl2, dNTPS, DMSO, Taq polymerase và các cặp mồi xác định gene kháng kháng sinh. Bảng 3.2: Trình tự nucleotide các cặp mồi trong phản ứng PCR xác định gene kháng kháng sinh. Nhóm kháng sinh Gene được kiểm tra Trình tự nucleotide của mồi (5'3') Mồi xuôi // Mồi ngược Độ dài (bp) β-Lactam blaSHV TCGCCTGTGTATTATCTCCC CGCAGATAAATCACCACAATG 768 Aminoglycosid aac(3)- IV GTGTGCTGCTGGTCCACAGC AGTTGACCCAGGGCTGTCGC 286 Tetracycline tetA GTGAAACCC AACATACCCC GAAGGCAAGCAGGATGTAG 888 Trimethoprim dhfrI AAGAATGGAGTTATCGGGAATG GGGTAAAAACTGGCCTAAAATTG 931 (Maynard et al., 2005) 3.2.1.3 Vật liệu nghiên cứu - 160 mẫu nghêu thu từ huyện Duyên Hải, huyện Cầu Ngang; 100 mẫu huyết heo thu từ các cơ sở giết mổ heo tại Thành phố Trà Vinh, huyện Châu Thành, huyện Duyên Hải, huyện Cầu Ngang và huyện Càng Long; 40 mẫu phân lấy từ bệnh nhân tiêu chảy tại bệnh viện Đa khoa tỉnh Trà Vinh; 150 mẫu nước thu từ sông, nước biển và các địa điểm nuôi tôm; 50 mẫu tôm thu từ huyện Duyên Hải. Tất cả các mẫu được bảo quản trong thùng trữ lạnh và chuyển về phòng thí nghiệm để nuôi cấy, phân lập. - Vaccine tả uống (mORCVAX) điều chế từ các chủng vi khuẩn tả gồm type sinh học Cổ điển và type sinh học El Tor và chủng vi khuẩn tả O139 (Công ty TNHH MTV Vaccine và Sinh phẩm số 1, Hà Nội); 24 thỏ trắng giống New Zealand, trọng lượng 2-2,5kg/con. 3.2.1.4 Thiết bị - Dụng cụ Tủ sấy, tủ ấm, tủ lạnh, autoclave, máy lắc, buồng cấy vô trùng và kính hiển vi, cân điện tử, ống nghiệm, đĩa petri, chai, ống đong, ống hút, lam, kẹp, kéo, tăm bông vô trùng, găng tay, đèn cồn, túi nilon. 3.2.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.2.1 Phương pháp phân lập, định danh vi khuẩn * Phương pháp lấy mẫu 9 Mẫu nghêu: nghêu được thu mua tại các chợ huyện Duyên Hải và Cầu Ngang, nghêu còn tươi (25gram/con), rửa sạch chất bẩn bên ngoài, lấy phần thịt cắt nhuyễn (1gram) tăng sinh trong 9 ml môi trường ASPW. Mẫu huyết heo: được thu từ các cơ sở giết mổ thuộc Thành phố Trà Vinh và các huyện: Châu Thành, Duyên Hải, Cầu Ngang và Càng Long, ở mỗi cơ sở đều lấy 25 ml mẫu/lần có pha nước muối với tỉ lệ 0,5%, mẫu được chuyển về phòng thí nghiệm, sau đó hút l ml mẫu đem tăng sinh trong 9 ml môi trường ASPW . Mẫu nước: được thu trên bề mặt nước tại các ao nuôi tôm, nước sông, nước biển (mỗi loại 25 ml mẫu), sau đó lấy 1ml nước tăng sinh trong 9ml môi trường ASPW. Mẫu tôm: được thu từ huyện Duyên Hải, tôm còn tươi (150gram/con) tôm được rửa sạch lấy phần đầu, cắt nhuyễn 1gram mẫu, lọc lấy dịch trong và tăng sinh trong 9 ml môi trường ASPW. Mẫu phân bệnh nhân tiêu chảy: dùng tăm bông vô trùng lấy phân của bệnh nhân tiêu chảy, bảo quản ở môi trường vận chuyển Carry-Blair, và chuyển về phòng thí nghiệm để nuôi cấy, phân lập. * Phương pháp nuôi cấy Các loại mẫu đều được nuôi tích lũy 2 lần trong môi trường ASPW. 1 ml mẫu được tăng sinh trong 9 ml môi trường ASPW ủ lần 1 ở 370C từ 6-8 giờ. Sau đó lấy 1 ml từ môi trường trên cho vào 9 ml môi trường ASPW ủ lần 2 ở 41,50C từ 16-18 giờ; sau đo phân lập trên môi trường chuyên biệt TCBS ở 370C/ 24 giờ: khuẩn lạc có thể có màu vàng/xanh. Chọn khuẩn lạc điển hình cấy chuyển sang môi trường thạch dinh dưỡng có muối (SNA), trên SNA khuẩn lạc Vibrio spp. tròn, trơn, láng, màu trắng sữa. a. Xác định V. cholerae bằng phản ứng sinh hóa (quy trình ISO/TS 21872-1:2007) Các thử nghiệm sinh hoá quan trọng để phát hiện hay phân biệt các loài Vibrio được thực hiện theo quy trình ISO/TS 21872-1:2007 (E). Chọn khuẩn lạc trên SNA để thử nghiệm các phản ứng với oxidase; kiểm tra tính lên men đường glucose/lactose; khả năng sinh hơi và sinh H2S; thử phản ứng sinh Indole và sự di động. Thử tính ưa mặn của Vibrio spp. ở các nồng độ NaCl khác nhau (0%, 2%, 6%, 8% và 10%). 10 * Nhuộm Gram: Vi khuẩn Vibrio spp. thuộc nhóm Gram âm nên sau khi nhuộm Gram vi khuẩn bắt màu hồng nhạt và có hình que ngắn, sau đó xem dưới kính hiển vi điện tử. b. Xác định chủng V. cholerae bằng máy định danh tự động (Vitex 2 compact- Biomerieux - BVĐK Trung ương Cần Thơ). Nguyên lý định danh vi sinh vật là dùng phương pháp đo màu để nhận biết các tính chất sinh hoá của vi sinh vật thông qua sự thay đổi màu của các giếng môi trường có sẵn trong thẻ (card). Các thẻ định danh được phủ hoá chất tối đa 64 giếng, các giếng có hoá chất đặc biệt phù hợp với tính chất sinh hoá của vi sinh vật khác nhau. c. Phương pháp định type huyết thanh học Việc định type huyết thanh của V. cholerae được thực hiện bằng phản ứng ngưng kết với 4 loại kháng huyết thanh Inaba, Ogawa, O139 và kháng huyết thanh đa giá Inaba + Ogawa + O139 (Trần Linh Thước, 2009) d. Xác định vi khuẩn Vibrio spp. bằng kỹ thuật PCR Các gốc vi khuẩn thuần được kiểm tra bằng kỹ thuật PCR, dựa trên gene 16S rRNA. Sản phẩm PCR được phân tích trên gel agarose 1,5% trong dung dịch đệm TBE 1X ở điện thế 100V trong 90 phút và chụp bằng máy chụp hình gel Biorad UV 2000, thang chuẩn 100 bp (công ty Fermentas). 3.2.2.2 Phân tích trình tự gene 16S RNAvà thiết lập cây di truyền. Sản phẩm PCR (DNA) ký hiệu 6 trình tự của 6 chủng thuộc Vibrios: V. cholerae-Ng3, V. cholerae-O3.2, V. cholerae-O1.2, V. cholerae-81V1, V. cholerae-N8 và V. cholerae-85V1, được giải trình tự tại công ty Macrogen Inc (Hàn Quốc). Các trình tự được phân tích và đọc bằng phần mềm Bio.Edit, sau đó so sánh với các trì