Tóm tắt Luận án Nghiên cứu vật liệu khởi đầu phục vụ chọn tạo giống đậu xanh kháng bệnh khảm vàng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ---------------------------------------- BÙI THỊ THU HUYỀN NGHIÊN CỨU VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU PHỤC VỤ CHỌN TẠO GIỐNG ĐẬU XANH KHÁNG BỆNH KHẢM VÀNG Chuyênngành : Di truyền và chọn giống cây trồng Mãsố : 62.62.01.11 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI – 2016 Công trình được hoàn thành tại: VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Hà Viết Cường, Học viện Nông nghiệp Việt Nam 2. TS. Trần Danh Sửu, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam Phản biện 1: Phản biện 2 Phản biện 3: Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện họp tại Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam Vào hồi giờ ngày tháng năm 2016 Có thể tìm hiểu luận án tại: 1. Thư Viện Quốc gia 2. Thư Viện Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Đậu xanh là một trong những cây thực phẩm họ đậu quan trọng trên thế giới và Việt Nam. Bệnh khảm vàng là bệnh phổ biến trên cây đậu xanh ở một số nước và có phổ ký chủ rộng. Nguyên nhân gây bệnh là do một hoặc nhiều virus thuộc chi Begomovirus gây ra và được lan truyền bởi bọ phấn theo cơ chế không bền vững. Chỉ thị phân tử liên kết với tính kháng bêṇh đa ̃ đươc̣ báo cáo đều liên kết xa với tính trạng. Tại Việt Nam, bệnh đã được quan sát từ những năm 1980 nhưng chưa có nghiên cứu nào xác định virus gây bệnh cũng như xác định gen kháng. Vì thế, công tác đánh giá tập đoàn đậu xanh để tìm ra nguồn gen kháng bệnh, nghiên cứu xác định cơ sở di truyền tính kháng, lập bản đồ định vị gen kháng sẽ góp phần thúc đẩy công tác khai thác, sử dụng các nguồn gen kháng làm nguồn vật liệu cho chương trình chọn tạo giống đậu xanh kháng bệnh ở nước ta. Xuất phát từ yêu cầu thực tế sản xuất đậu xanh, nhằm cung cấp thêm cơ sở khoa học và vật liệu cho công tác chọn tạo giống đậu xanh kháng bệnh, đề tài: "Nghiên cứu vật liệu khởi đầu phục vụ chọn tạo giống đậu xanh kháng bệnh khảm vàng" đã được tiến hành.. 2. Mục tiêu của đề tài Tìm hiểu, xác định bản chất di truyền tính kháng bệnh khảm vàng trên cây đậu xanh ở mức phân tử, giới thiệu nguồn vật liệu cho công tác chọn tạo giống đậu xanh kháng bệnh. Mục tiêu cụ thể của đề tài: - Xác định được virus gây bệnh khảm vàng trên đậu xanh tại Việt Nam. - Xác định được di truyền tính kháng bệnh khảm vàng ở cây đậu xanh. - Xác định được các QTL kháng bệnh khảm vàng. - Giới thiệu được một số nguồn gen đậu xanh triển vọng làm vật liệu khởi đầu cho công tác chọn tạo giống đậu xanh kháng bệnh khảm vàng và năng suất cao tại Việt Nam. 3. Ý nghiã khoa hoc̣ và thưc̣ tiêñ của đề tài Việc xác định được nguyên nhân gây bệnh khảm vàng trên cây đậu xanh tại Việt Nam là MYMV, xác định nguồn gen kháng bệnh, đánh giá đa dạng di truyền, thiết 2 lập bản đồ gen kháng ở giống đậu xanh làm cơ sở khoa hoc̣ cho công tác chọn tạo giống đậu xanh kháng bệnh. Xác định di truyền tính kháng bệnh và các chỉ thị SNP liên kết với gen kháng bệnh khảm vàng ở giống đậu xanh nhập nội NM94 không chỉ nhằm xác định nguồn gen kháng mà còn có ý nghĩa thực tiễn cao trong việc khai thác hiệu quả các nguồn gen kháng bêṇh phục vụ công tác choṇ taọ giống đâụ xanh kháng bêṇh. 4. Những đóng góp mới của luận án Đây là đề tài đầu tiên ở Việt Nam đã xác định được virus gây bệnh khảm vàng trên cây đậu xanh là MYMV. Đã thiết lập được bản đồ di truyền gồm 11 liên kết tương ứng với 11 nhiễm sắc thể trên bộ gen của cây đậu xanh dựa trên chỉ thị SNP bằng phương pháp GBS. Đã xác định được vị trí các QTL kháng bệnh khảm vàng trên bản đồ di truyền và bản đồ vật lý ở nguồn gen đâụ xanh nhâp̣ nôị NM94. 5. Bố cục của luận án Luận án được trình bày trong 121 trang (không kể phần Tài liệu tham khảo và Phụ lục): Mở đầu (4 trang), Chương 1: Tổng quan và cơ sở khoa học của Đề tài (39 trang), Chương 2: Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu (14 trang), Chương 3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận (62 trang), Kết luận và đề nghị (2 trang). Tài liệu tham khảo được sử dụng 158, trong đó có 20 tài liệu tiếng Việt và 138 tài liệu tiếng Anh. Luận án có 31 bảng, 40 hình, 13 phụ lục, 4 công trình đã công bố. CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIÊỤ VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI Luận án đã tham khảo và tổng quan 20 tài liệu tiếng Việt và 138 tài liệu tiếng Anh, với các nội dung liên quan bao gồm: 1. Giới thiệu chung về cây đậu xanh; 2. Nghiên cứu đa dạng di truyền cây đậu xanh; 3. Những nghiên cứu về bệnh khảm vàng đậu xanh; 4. Nghiên cứu lập bản đồ di truyền và tiềm năng ứng dụng trong cải tiến giống ở cây đậu xanh; 5. Nghiên cứu sử dụng chỉ thị phân tử và lập bản đồ phân tử ở Việt Nam. Với các tài liệu thu thập được đã khẳng định cây đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek.) có nguồn gốc Ấn Độ và được thuần hóa từ 1500 năm trước công nguyên 3 (Mogotsi, 2006). Đậu xanh rất giàu và cân đối protein, thời gian sinh trưởng ngắn, có khả năng chịu hạn, thích ứng rộng với môi trường (Phạm Văn Thiều, 2009). Diện tích trồng đậu xanh trên toàn thế giới đạt trên 6 triệu ha nhưng năng suất đậu xanh hiện nay còn thấp (Nair et al., 2012). Đậu xanh là cây trồng tự thụ, bộ nhiễm sắc thể 2n=2x=22, kích thước bộ gen khoảng 579 Mbp (Somta và Srinives, 2007) và có nền di truyền rất hẹp (Nair et al., 2012). Bệnh khảm vàng (Mungbean yellow mosaic virus – MYMV) là bệnh hại nghiêm trọng đến canh tác đậu xanh. Bệnh được quan sát thấy lần đầu tiên vào năm 1955 tại Viện nghiên cứu Nông nghiệp Ấn Độ (IARI) (Nariani, 1960), sau đó được phát hiện tại một số quốc gia khác thuộc khu vực Nam Á và Đông Nam Á như Philippines (Benigno và Favali-Hedayat, 1977), Thái Lan (Thongmeearkom et al., 1981), Papua New Guinea (Pearson, 1981), SriLanka (Shivanathan, 1983), Bangladesh (Akanda et al., 1992), Pakistan (Saleem et al., 1998), Myammar (Han et al., 2001) cho thấy đây là bệnh quan trọng gây hại trên đậu xanh. Bệnh có phổ ký chủ rộng, không chỉ gây hại trên đậu xanh mà còn gây hại trên một số loài cây họ đậu khác như đậu xanh đen, đậu tương, đậu cowpea (Varma, 1992). Nguyên nhân gây bệnh là do một hoặc nhiều virus thuộc chi Begomovirus (họ Geminivirus) gây ra và được lan truyền bởi vectơ truyền bệnh là bọ phấn (Bemisia tabaci Genn.) theo cơ chế không bền vững (Nariani, 1960). Bệnh đã từng gây hại rất nghiêm trọng, làm mất 100% năng suất tại Thái Lan và Ấn Độ (Thogmeearkhom et al., 1981; Manjunath et al., 2013), gây thiệt hại kinh tế trên 300 triệu USD (Varma, 1992). Tại Việt Nam, đậu xanh là cây đậu đỗ đứng thứ ba sau lạc và đậu tương. Đậu xanh được trồng từ Bắc vào Nam. Diện tích trồng đậu xanh của Việt Nam năm 2015 là 90.950 ha trong đó các tỉnh Bắc Trung Bộ, Nam Trung Bộ và Tây Nguyên là vùng trồng chính với 67,8% diện tích trồng cả nước (2015). Bệnh khảm vàng trên cây đậu xanh đã được quan sát ở Việt Nam với các triệu chứng điển hình từ những năm 1980 (Phan Hữu Trinh và cs., 1986) và mặc dù chưa có một nghiên cứu chính thức nào về thiệt hại do MYMV gây ra đối với đậu xanh nhưng đã có những ước đoán về thiệt hại của bệnh gây mất năng suất từ 20-70% (Phạm Văn Thiều, 2009). Sử dụng các giống kháng bệnh được đánh giá là mang lại hiệu quả tối ưu, là 4 cách ổn định và an toàn để quản lý dịch bệnh. Nghiên cứu xác định nguồn gen kháng đã và đang được tiến hành tại nhiều quốc gia khác thế giới và Việt Nam. Một số nguồn gen kháng bệnh khảm vàng trên đậu xanh đã được phát hiêṇ (Shad et al., 2006; Habib et al., 2007). Một số công trình nghiên cứu đã chỉ ra rằng di truyền tính kháng của MYMV được kiểm soát bằng đa gen. Tính kháng được quy định bằng đơn gen lặn (Singh và Patel, 1977; Reddy, 2009; Sudha et al., 2013a), một gen trội (Gupta et al., 2005), hai gen lặn (Ammavasai et al., 2004; Singh et al., 2013) và các gen lặn bổ sung (Dhole và Reddy, 2012). Với sự phát triển nhanh chóng của công nghệ chỉ thị phân tử, nhiều locut gen kháng sâu bệnh chính đã được định vị trên bản đồ bộ gen của cây đậu xanh (Chen et al., 2007; Zang et al., 2008). Chỉ thị phân tử liên kết với gen kháng bêṇh khảm vàng trên đâụ xanh cũng đa ̃đươc̣ báo cáo nhưng các chỉ thị này đều liên kết xa với tính trạng (Somta và Srinives, 2007; Dhole và Reddy, 2013). Trong số các chỉ thị phân tử, SNP là chỉ thị thế hệ mới, có số lượng cao trong bộ gen do vậy được ứng dụng tốt cho tăng mật độ chỉ thị, lập bản đồ QTL và chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử với nhiều thông tin (Choudhary et al., 2012). Sự phát triển nhanh chóng của các công nghệ giải trình tự thế hệ mới đã giúp dễ dàng phát hiện các SNP trên toàn bộ hệ gen. Công tác đánh giá khả năng kháng bệnh khảm vàng của tập đoàn đậu xanh để tìm ra nguồn gen kháng bệnh, lập bản đồ định vị gen kháng sẽ góp phần thúc đẩy công tác khai thác, sử dụng các nguồn gen kháng làm nguồn vật liệu cho chương trình chọn tạo giống đậu xanh kháng bệnh ở Việt Nam. CHƯƠNG 2 VÂṬ LIÊỤ, NÔỊ DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2. 1. Vật liệu nghiên cứu - Giống đậu xanh: + Thí nghiệm sàng lọc nguồn gen đậu xanh kháng bệnh khảm vàng: gồm 96 nguồn gen đậu xanh địa phương và nhập nội đang được lưu giữ tại ngân hàng gen cây trồng Quốc bao gồm giống đối chứng nhiễm bệnh chuẩn là KPS2 (Akatar et al., 2011) có nguồn gốc từ AVRDC (Bảng 2.1 và Phụ lục 1) + Thí nghiệm đánh giá đa dạng di truyền đậu xanh: gồm 94 nguồn gen trong đó có nguồn gốc từ Việt Nam (50 nguồn gen), AVRDC (13 nguồn gen) và Úc (31 nguồn 5 gen) (chi tiết ở Phụ lục 2) + Quần thể lập bản đồ: 200 dòng quần thể đậu xanh F3 do AVRDC khu vực Nam Á đóng tại ICRISAT, Hyderabad, Ấn Độ tạo ra từ tổ hợp lai NM94 (kháng MYMV) và KPS2 (nhiễm MYMV). - Nguồn bệnh: là những cây đậu xanh bị bệnh khảm vàng thu thập tại Phú Yên với triệu chứng điển hình. - Các vật liệu hóa chất dùng trong sinh học phân tử 2.2. Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Phân lập và xác định virus gây bệnh khảm vàng ở Việt Nam Nội dung 2: Nghiên cứu khả năng kháng bệnh khảm vàng và đặc điểm nông sinh học của các mẫu giống trong tập đoàn đậu xanh Nội dung 3: Nghiên cứu đa dạng di truyền của cây đậu xanh Nội dung 4: Nghiên cứu lập bản đồ gen của cây đậu xanh 2.3.1. Thời gian nghiên cứu: từ năm 2011 đến năm 2015. 2.3.2. Địa điểm nghiên cứu - Các nghiên cứu đánh giá tính kháng bệnh trên đồng ruộng được thực hiện tại Nam An Nghiệp, Tuy An, Phú Yên - Các thí nghiệm đánh giá bệnh trong điều kiện lây nhiễm nhân tạo được thực hiện tại hệ thống nhà lưới chống côn trùng của Trung tâm Bệnh cây nhiệt đới, Học viện Nông nghiệp Việt Nam và Trung tâm Tài nguyên Thực vật. - Các thí nghiệm nghiên cứu về sinh học phân tử được thực hiện tại Bộ môn Đa dạng Sinh học Nông nghiệp - Trung tâm Tài nguyên Thực vật, Trung tâm Bệnh cây nhiệt đới – Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Phòng virus học và Phòng chỉ thị phân tử - Trung tâm Rau thế giới (AVRDC, Đài Loan). 2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.4.1. Phương pháp xác định virus gây bệnh khảm vàng đậu xanh Phương pháp thu mẫu bệnh: Thu thập và bảo quản mẫu bệnh được tiến hành theo AVRDC như sau: Thu mẫu bệnh là lá và quả non ngẫu nhiên trên đồng ruộng và ghi chép các thông tin liên quan tại các vùng trồng đậu xanh chính và các cây họ đậu khác theo biểu mẫu của DSMZ. Mẫu được làm khô bằng silicagen tự chỉ thị và được bảo quản 6 trong lọ hoặc ống falcon kín chứa silicagen và bảo quản ở điều kiêṇ thường. Tách chiết ADN tổng số Tách chiết ADN tổng số bằng dung dịch đệm CTAB (Doyle và Doyle, 1987). Kiểm tra chất lượng ADN trên gel agarose 0,8%. Tinh sạch ADN bằng Kit ZR-96 DNA clean and concentratorTM-5 (Zymo Research). Nồng độ chính xác được đo trên máy quang phổ nanodrop. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1,2 % trong TBE 0,5X. Phương pháp tách dòng và giải trình tự ADN của begomovirus Dựa vào việc căn trình tự của các sản phẩm PCR 1,5kb và trình tự nucleotide thu được trên GenBank, thiết kế mồi khuếch đại các đoạn ADN-A và ADN-B hoàn chỉnh của các chủng MYMV từ Việt Nam. Các đoạn ADN-A và ADN-B hoàn chỉnh này sau đó được tách dòng và giải trình tự. Nhân dòng bằng vectơ pGEM-T Easy theo chỉ dẫn của nhà sản xuất (Promega, WI, USA). Sản phẩm nhân dòng được nhuộm bằng BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit và giải trình tự bằng thiết bị ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, San Francisco, CA, USA) tại công ty Yourgene (Đài Loan). Phân tích trình tự của các ADN begomovirus Sử dụng BLASTn trên NCBI để tìm kiếm các trình tự của geminivirus trên cơ sở dữ liệu của GenBank tương đồng nhất với trình tự ADN hoàn chỉnh thu được (Altschul et al., 1990). Phần mềm ClustalX2 2.0 (Larkin et al., 2007) được sử dụng để căn trình tự và so sánh trình tự. Cây đa dạng di truyền (Phylogenetic tree) của các ADN-A và ADN-B của virus được tạo ra bằng phần mềm MEGA6 (Tamura et al., 2013). Kỹ thuật ELISA Kỹ thuật ELISA là TAS-ELISA (Triple antibody sandwich –ELISA) được sử dụng để chẩn đoán một virus rất phổ biến trên cây đậu đỗ tại Việt Nam là Bean common mosaic virus. Kit ELISA do Viện DSMZ (Đức) cung cấp và qui trình được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất. 7 2.4.2. Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền sử dụng DArT Tách chiết ADN Các nguồn gen nghiên cứu được gieo trồng, thu lá non từ 5 cây/nguồn gen để tách chiết ADN tại Phòng chỉ thị phân tử, AVRDC - Đài Loan. Tách chiết ADN theo phương pháp chiết ADN tổng số bằng dung dịch đệm CTAB (Doyle và Doyle, 1987). Sau khi tách chiết ADN của đậu xanh, các mẫu ADN này được gửi đến công ty Diversity Arrays Technology, Bldg 3, Lv D, University of Canberra, Kirinari st., Bruce, ACT 2617, Australia để thực hiện các bước tiếp theo của quy trình DArT và nhận lại số liệu thô cho phân tích đa dạng di truyền. Phân tích số liệu DarT Các dòng DArT đa hình với P lớn hơn hoặc bằng 80 được lựa chọn để phân tích đa dạng di truyền của đậu xanh sử dụng phần mềm DARwin 6. Sơ đồ hình cây được xây dựng dựa trên khoảng cách di truyền của Nei (1978) theo phương pháp UPGMA bằng phần mềm DARwin 6. 2.4.3. Phương pháp đánh giá khả năng kháng bệnh khảm vàng của đậu xanh 2.4.3.1. Đánh giá trong điều kiện áp lực bệnh tự nhiên Địa điểm thí nghiệm: Nam An Nghiệp, Tuy An, Phú Yên ở vụ Hè (là vùng xuất hiện bệnh trong nhiều năm liên tục). Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm sàng lọc nguồn gen kháng bệnh của tập đoàn đậu xanh: được bố trí theo khối ngẫu nhiên hoàn chỉnh (RCBD) với 3 lần lặp, khoảng cách hàng x hàng: 40cm, cây x cây: 10cm, 15 cây/hàng/lần lặp. Thí nghiệm đánh giá khả năng kháng bệnh khảm vàng của các dòng trong quần thể F2:3: được bố trí tuần tự không nhắc lại, khoảng cách hàng x hàng: 40 cm, cây x cây: 10 cm, 30 cây/dòng. Các cây này được đeo thẻ từ 35 ngày sau trồng để phục vụ cho quá trình đánh giá. Quy trình kỹ thuật chăm sóc chung đối với cây đậu xanh được áp dụng cho thí nghiệm, nhưng không sử dụng thuốc bảo vệ thực vật để không ảnh hưởng đến quần thể bọ phấn - vector truyền bệnh. Cấp bệnh được đánh giá trên từng cây theo thang điểm 6 cấp (được cung cấp bởi AVRDC) tại thời điểm cây được 35 và 55 ngày trồng. 8 2.4.3.2. Đánh giá trong điều kiện lây nhiễm nhân tạo nhờ bọ phấn Chuẩn bị cây nguồn nhiễm bệnh bằng lây nhiễm nhân tạo nhờ vi khuẩn (Agroinoculation). Lây nhiễm nhân tạo bằng phương pháp ủ hạt qua đêm (Mandal et al., 1997). Lây nhiễm nhân tạo sử dụng bọ phấn Các dòng đánh giá được gieo trong khay xốp, mỗi dòng trồng 30 cây, gieo 1 hạt/hốc, đặt trong nhà lưới. Khi cây mọc và được 10 ngày sau gieo tiến hành cho lây nhiễm nhờ bọ phấn. Chuyển cây bị bệnh (cây nguồn) vào lồng kín, thả bọ phấn khỏe với mật độ 4-6 con/cây. Sau thời gian 2 ngày, tiếp tục chuyển cây không bị bệnh vào lồng chứa bọ phấn đã mang bệnh ngay sau khi mang cây bị bệnh ra ngoài. Chăm sóc hàng ngày và theo dõi kết quả sau 2 tuần lây nhiễm khi 100% cây của giống mẫn cảm KPS2 đã biểu hiện triệu chứng điển hình của bệnh và có kết quả dương tính với MYMV (PRC test). Mỗi cây được đeo thẻ đánh số để đánh giá bệnh theo thang điểm của AVRDC ở giai đoạn 35 ngày và 55 ngày sau trồng. 2.4.3.3. Phân tích thống kê: Tính tỷ lệ bệnh (TLB) theo phương pháp của Vũ Đình Ninh (1972) và chỉ số cấp bệnh trung bình (CBTB) tính theo Fang (2010) 2.4.4. Phương pháp đánh giá kiểu gen bằng giải trình tự (GBS) 2.4.4.1. Thiết lập thư viện cho GBS theo mô tả chi tiết trong công bố của Elshire et al., 2011. 2.4.4.2. Xử lý số liệu bằng các phần mềm tin sinh học Sử dụng bộ công cụ STACKS 1.21 (Catchen et al., 2013) và Bộ công cụ GATK (https://www.broadinstitute.org/gatk/) chạy trên hệ điều hành Linux 32G-RAM để gọi ra các chỉ thị SNP 2.4.5. Phân tích QTLs (Quantitative Trait Loci) Sử dụng các phần mềm QTL Icimapping 4.0 (Li et al., 2007) và Qgene 4.3 (Li et al., 2007) để phân tích QTLs. 9 CHƯƠNG 3 KẾT QUÁ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập và xác định virus gây bệnh khảm vàng trên đậu xanh 3.1.1. Kết quả thu mẫu bệnh khảm vàng trên cây đậu xanh, các cây họ đậu khác tại Việt Nam Mẫu bệnh khảm vàng đã được thu thập tại 17 tỉnh, thành trong cả nước. Tổng cộng đã thu được 68 mẫu bệnh, 57 mẫu bệnh trên đậu xanh, 11 mẫu bệnh trên các cây họ đậu khác. Trong đó 16 mẫu bệnh thu tại Phú Yên trên cây đậu xanh, 10 mẫu bệnh thu tại Hà Nội (9 mẫu bệnh trên đậu xanh, 1 mẫu bệnh trên đậu đen), 7 mẫu bệnh thu tại Thái Bình trên đậu xanh, còn lại các mẫu bệnh khác được thu rải rác trên các tỉnh thành khác (Bảng 3.1, Hình 3.2). Triệu chứng của cây bị bệnh khảm vàng thu mẫu bệnh được thể hiện trong Hình 3.1. Bảng 3.1: Tổng hợp kết quả điều tra, thu thập mẫu bệnh Begomovirus theo vùng địa lý Tính đến ngày 15 tháng 12 năm 2013 TT Vùng, địa phương Đậu xanh Cây khác TT Vùng, địa phương Đậu xanh Cây khác 1 Bắc Giang 1 - 10 Thái Bình 7 - 2 Bắc Ninh 1 - 11 Thanh Hóa 2 - 3 Yên Bái 2 2 12 Nghệ An 2 - 4 Bắc Cạn 1 13 Quảng Trị 1 - 5 Sơn La 4 3 14 Đà Nẵng 4 - 6 Lào Cai 1 - 15 Bình Định 3 - 7 Q.Ninh 4 16 Phú Yên 16 - 8 Hà Nội 9 1 17 Cần Thơ 2 - 9 Hưng Yên 2 - Tổng số 57 11 Hình 3.1: Các triệu chứng khảm vàng ở đậu xanh tại Phú Yên Hình 3.2: Định vị các vùng thu thập mẫu bệnh khảm vàng chính tại Việt Nam, năm 2011-2013 10 3.1.2. Thiết kế mồi phát hiện các virus gây hại trên cây đậu xanh và các cây họ đậu khác bằng kỹ thuật PCR Vì các begomovirus trên cây họ đậu chủ yếu là các begomovirus có bộ gen kép nên 2 loại mồi sẽ được thiết kế là các mồi đặc hiệu MYMV và các mồi chung đặc hiệu cho tất cả các begomovirrus gây hại trên cây họ đậu (còn được gọi là các legumovirus) từ cựu thế giới. Kết quả đã thiết kế được 7 mồi có thể phát hiện các begomovirus có bộ gen kép gây hại trên cây họ đậu và mồi đặc hiệu phát hiện MYNV (Bảng 3.2). Bảng 3.2: Kết quả thiết kế mồi cho ADN-A của begomovirus TT Tên mồi Trình tự mồi (5’-3’) (*) Số Nu Tm Vị trí Kích thước (bp) 1 LegA-repF1 ATAATGBGGATC RACGTCATC 21 49-53 1846-1866 F1/R1 = 634 F1/R2 = 548 2 LegA-repR1 TCAYCTVCATGT TCTGCTTC 20 43-48 2461-2480 3 LegA-repR2 CAYATTWCCAT CCGAACATTCAG 23 51 2372-2394 4 LegA-cpF1 GGTCAAGTKTTY AACATGTATGA 23 46-48 770-820 280 5 LegA-cpR1 GCATGAGTACAT GCCATATAC 21 49 1000-1050 6 MYA-For1 CAATTTGAGTGC TGTGTTATCAG 23 52 1773 – 1795 566 7 MYA-Rev1 CTCAATAGTGGA TCCAAGTTAC 22 49 2316-2339 *: Y: C/T, R: G/A, H: A/C/T, M: A/C, B: C/G/T, D: A/G/T, K: G/T; i=inosine. 3.1.3. Kết quả chuẩn đoán bệnh virus trên đậu xanh và các cây họ đậu khác bằng kỹ thuật PCR Kết quả chuẩn đoán bằng PCR 68 mẫu bệnh thu được (Bảng 3.3), tất cả 11 mẫu bệnh của cây họ đậu khác đều biểu hiện dương tính với begomovirus, legumovirus, MYMV. 25 trên tổng số 57 mẫu bệnh đậu xanh dương tính với begomovirus, 11 legumovirus, MYMV. Có 4 địa phương phát hiện mẫu đậu xanh nhiễm MYMV, 5 địa phương phát hiện MYMV trên các cây họ đ