Tóm tắt Luận án Tạo thể lai mang gen kháng bệnh mốc sương bằng dung hợp tế bào trần giữa khoai tây dại và khoai tây trồng

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM HOÀNG THỊ GIANG TẠO THỂ LAI MANG GEN KHÁNG BỆNH MỐC SƯƠNG BẰNG DUNG HỢP TẾ BÀO TRẦN GIỮA KHOAI TÂY DẠI VÀ KHOAI TÂY TRỒNG CHUYÊN NGÀNH: DI TRUYỀN VÀ CHỌN GIỐNG CÂY TRỒNG MÃ SỐ: 62 62 01 11 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÀ NỘI - 2016 Công trình hoàn thành tại: HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Ngƣời hƣớng dẫn: 1. GS.TS. NGUYỄN QUANG THẠCH 2. TS. RAMONA THIEME Phản biện 1: PGS.TS. NGUYỄN ĐỨC THÀNH Viện Công nghệ Sinh học Phản biện 2: PGS.TS. HÀ VIẾT CƢỜNG Học viện Nông nghiệp Việt Nam Phản biện 3: PGS.TS. ĐẶNG TRỌNG LƢƠNG Viện Di truyền Nông nghiệp Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Học viện họp tại: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Vào hồi giờ, ngày tháng năm 2016 Có thể tìm hiểu luận án tại thƣ viện: - Thƣ viện Quốc gia Việt Nam - Thƣ viện Học viện Nông nghiệp Việt Nam 1 PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Trong các bệnh gây hại khoai tây, bệnh mốc sương do Phytophthora infestans (Mont.) de Bary gây ra được coi là bệnh phổ biến và nguy hại nhất. Trong điều kiện thuận lợi bệnh có thể phát triển nhanh thành dịch, phá hủy toàn bộ mùa màng trong vòng một đến hai tuần lễ. Việc sử dụng biện pháp phòng chống bệnh hại bằng thuốc hóa học vừa gây ô nhiễm môi trường vừa tăng chi phí sản xuất (Darsow et al., 2008) nhưng vẫn không giảm thiệt hại hoàn toàn. Hơn nữa, nấm mốc sương có tính di truyền khá linh động và thích ứng cao nên dễ kháng các loại thuốc hóa học. Chọn giống kháng bệnh mốc sương được coi là một biện pháp hiệu quả. Chọn giống khoai tây kháng bệnh vào đầu thế kỷ 20 (những năm 1950 và 1960) tập trung vào việc sử dụng các gen trội (R còn gọi là gen Rpi) chính kháng mốc sương từ loài hoang dại Solanum demissum và 11 gen R được chuyển vào khoai tây. Mặc dù gen kháng chính có hiệu quả cao, nhưng tính kháng ở các giống mang gen kháng chính R nhanh chóng bị vượt qua vì nấm mốc sương có khả năng thích nghi với cây kháng rất nhanh (Fry, 2008; McDonald and Linde, 2002). Tuy nhiên, nhiều chiến lược khác nhau được xem xét để sử dụng nhiều gen kháng để tạo ra khả năng kháng đồng ruộng bền vững (Jones, 2001; Park et al., 2009; Darsow, 2014) và sử dụng các gen kháng từ nhiều loài hoang dại khác nhau. Các gen kháng từ các nguồn khác nhau được tích tụ nhờ phương pháp lai chuyển gen truyền thống và sử dụng chị thị phân tử (Tan et al., 2008, 2010). Các nghiên cứu gần đây cho thấy nhiều loài khoai tây dại mang nguồn gen kháng bệnh mốc sương cao (Szczerbakowa et al., 2005, Thieme et al., 2008, 2010). Tuy nhiên, rất khó để chuyển đặc tính kháng này qua con đường lai hữu tính giữa các loài hoang dại (2n = 2x = 24) với khoai tây trồng (2n = 4x = 48) do cơ chế cách ly về sinh sản (Jackson and Hanneman, 1999), cụ thể là sự khác biệt về số lượng nhiễm sắc thể và số cân bằng nội nhũ (Borgato et al., 2007; Tiwari et al,, 2010). Để khắc phục rào cản lai này nhà chọn giống có thể sử dụng kỹ thuật nhiễm sắc thể, lai bắc cầu, thụ phấn mento, xử lý auxin và cứu phôi. Dung hợp tế bào trần để tạo con lai, gọi là con lai soma, là một giải pháp để khắc phục rào cản lai xa (Oberwalder et al., 2000; Wielgat and Wasilewska, 2001) và chuyển nhiều gen kháng vào khoai tây trồng. Dung hợp tế bào trần hay lai soma có thể chuyển các tính trạng đơn gen và đa gen từ các loài hoang dại vào khoai tây nhưng vẫn bảo toàn được hệ gen nhân và tế bào chất (Gavrilenko et al., 2003) và tạo ra nguồn vật liệu đa dạng mang mức kháng bệnh cao (Mattheij et al., 1992; Thach et al., 1993; Davey et al., 2005; Thieme et al., 2010). 1.2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI Xác định được các thông số để tách, dung hợp, nuôi cấy tái sinh tế bào trần giữa các loài khoai tây dại nhị bội kháng bệnh mốc sương và các giống khoai tây 2 trồng mẫn cảm với bệnh mốc sương. Tạo được các con lai soma bằng dung hợp tế bào trần giữa các loài khoai tây dại nhị bội với các giống khoai tây trồng tứ bội nhằm chuyển tính kháng bệnh mốc sương từ loài dại vào khoai tây trồng. Tạo được các con lai lại (backcross) giữa các con lai soma với các giống khoai tây trồng tứ bội nhằm tạo được dòng vật liệu di truyền khoai tây mang gen kháng và có đặc điểm nông sinh học phù hợp phục vụ phát triển giống khoai tây kháng bệnh mốc sương ở Việt Nam. 1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU Trên cơ sở thu thập được nguồn vật liệu quý là các dòng khoai tây dại mang nguồn gen kháng bệnh mốc sương, đề tài tập trung nghiên cứu quy trình tách, dung hợp tạo các thể lai soma cải thiện được khả năng kháng bệnh mốc sương đồng thời tổ hợp được những tính trạng quý từ khoai tây trồng. Trên nền đa dạng di truyền đã tạo ra tiền hành đánh giá, chọn lọc các thể lai soma có khả năng kháng bệnh mốc sương và mang các đặc tính nông sinh học quý. 1.4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI Đã xác định được các thông số để dung hợp tế bào trần giữa khoai tây dại mang gen kháng bệnh mốc sương và khoai tây trồng bao gồm: nồng độ dung dịch enzym thích hợp cho từng dòng/giống; thời gian ủ thích hợp của các mẫu lá trong dung dịch enzyme đối với các dòng/giống khoai tây dao động từ 14-16 giờ; dung hợp ở thông số 800 kHz với 2 lần xung; mật độ tế bào thích hợp nhất để xung điện là từ 4x 105 tế bào/ml đến 5x 105 tế bào/ml; môi trường nuôi cấy các sản phẩm sau dung hợp là môi trường VKMII lỏng; môi trường Cul-medium để tạo callus và môi trường RJM để tái sinh chồi. Đã lai thành công soma bằng dung hợp tế bào giữa khoai tây dại nhị bội (2x) mang gen kháng bệnh mốc sương (S. bulbocastanum, S. pinnatisectum, S. tarnii) với giống khoai tây trồng (Solanum tuberosum L.) tứ bội (4x) mẫn cảm với bệnh mốc sương (Agave, Atlantic, Delikat, Quarta và Rasant) nhưng có năng suất và chất lượng tốt. Các con lai soma của tổ hợp lai giữa dòng khoai tây dại S.bulbocastanum với giống khoai tây trồng Delikat (2295/2, 2292/4, 2181/10 và 2283/5) mang gen kháng bệnh mốc sương Rpi-blb1 và Rpi-blb3 là nguồn vật liệu kháng bệnh khoai tây có giá trị cho chương trình chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh của Việt Nam. Đã lai trở lại thành công giữa các con lai soma với khoai tây trồng tạo được 11 tổ hợp lai và chọn được 4 con lai từ tổ hợp lai blb2G (+) Delikat/2283/5 x Delikat (13.1303.2, 13.1303.4, 13.1303.6 và 13.1303.11) mang gen kháng bệnh mốc sương đồng thời có các đặc điểm nông sinh học phù hợp, đây là nguồn vật liệu có giá trị cho chọn giống khoai tây kháng bệnh ở nước ta. 3 1.5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN 1.5.1. Ý nghĩa khoa học Đây là một nghiên cứu có tính khoa học chuyên sâu về di truyền chọn giống cây trồng. Đề tài cũng là một bước phát triển kỹ thuật cao của công nghệ tế bào thực vật (kỹ thuật dung hợp tế bào trần) trong tạo giống khoai tây. Các kết quả của đề tài có giá trị khoa học cả trong nước và quốc tế. Đề tài đã góp phần chứng minh khả năng chuyển được tính kháng bệnh mốc sương từ các loài khoai tây dại sang các giống khoai tây trồng thông qua dung hợp tế bào trần và ứng dụng thành công kết quả này trong chọn tạo các giống khoai tây trồng kháng các loại bệnh quan trọng. 1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn Nghiên cứu đã chọn tạo được thành công 4 dòng con lai soma và khoai tây trồng giống Delikat (blb2G (+) Delikat/2283/5 x Delikat là các dòng 13.1303.2, 13.1303.4, 13.1303.6 và 13.1303.11 có khả năng kháng bệnh mốc sương đồng thời có đặc điểm nông sinh học phù hợp. Đây là nguồn vật liệu có giá trị cho chương trình chọn giống khoai tây kháng bệnh mốc sương ở Việt Nam. PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. TÌNH HÌNH SẢN XUẤT KHOAI TÂY TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM Theo số liệu tổng kết của FAOSTAT (2014), tổng diện tích trồng khoai tây trên thế giới năm 2013 là 19.463.041 ha, trong đó khu vực Châu Á chiếm 51,68% tổng diện tích trồng khoai tây trên thế giới, Việt Nam có diện tích trồng khoai tây năm 2013 là 23.077 ha). Năng suất bình quân của thế giới là 18,9 tấn/ha trong đó năng suất bình quân thực tế của Việt Nam chúng ta mới chỉ đạt 13,6 tấn/ha. Vấn đề khó khăn nhất hiện nay đối với ngành sản xuất khoai tây đó là giống, đặc biệt là các giống khoai tây sạch bệnh. Hiện giống khoai tây ở trong nước mới chỉ đáp ứng từ 20-25% nhu cầu, số còn lại phải nhập khẩu từ Trung Quốc, Hà Lan 2.2. NGUỒN GEN KHOAI TÂY DẠI VÀ TÌNH HÌNH KHAI KHÁC NGUỒN GEN KHOAI TÂY DẠI Có rất nhiều các loài dại đã được phát hiện mang các đặc tính kháng sâu bệnh và chống chịu với các điều kiện bất thuận đã được phát hiện và khai thác vào nguồn gen khoai tây trồng. Ross (1986) đã chỉ ra rằng có 6 loài khoai tây dại được khai thác cho các giống khoai tây trồng của Châu Âu bao gồm: S. demissum (kháng mốc sương, PLRV), S. acaule (Kháng PVX, PLRV, PSTV, wart, Globoder và chịu sương giá), S. stoloniferum (Kháng PVA, PVY), S. chacoense (Kháng PVA, PVY, mốc sương, Colorado beetle, bọ nhậy), S. spegazzinii (kháng Fusarium, wart, Globodera), S. vernei (kháng GloboderaI, có hàm lượng tinh bột cao). Theo thời gian, nguồn gen kháng từ các loài khoai tây dại đã được khai thác và chuyển vào nguồn gen khoai tây trồng. 4 2.3. CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA PHƢƠNG PHÁP DUNG HỢP TẾ BÀO TRẦN Những khâu quan trọng của kỹ thuật này bao gồm: tách, nuôi cấy và tái sinh tế bào trần; dung hợp tế bào trần; chọn lọc các thể lai soma. Để tách được tế bào trần người ta có thể sử dụng hai phương pháp tách cơ học và tách bằng enzyme. Trong đó phương pháp enzyme hiện nay được sử dụng rộng rãi và có hiệu quả cao.Tế bào trần sau khi được tách được nuôi cấy trên những môi trường thích hợp có khả năng tái tạo thành tế bào, phân chia và tạo cây hoàn chỉnh. Những yêu cầu về mặt dinh dưỡng cho việc nuôi cấy tế bào trần gần giống với môi trường nuôi cấy mô tế bào. Các phương pháp nuôi cấy nói chung đã được nhiều tác giả công bố trong đó có phương pháp nuôi cấy dịch huyền phù và giọt. Tế bào trần được hòa lơ lửng trong môi trường lỏng ở mật độ khoảng 105 tế bào trần /ml trong hộp chứa một lớp mỏng môi trường và nuôi cấy trong điều kiện tĩnh. Quá trình nuôi cấy giọt đã được phát triển bởi Kao et al. (1974). Các tế bào trần sau khi nuôi cấy thường có biểu hiện tăng thể tích tế bào chất, tăng kích thước và phát sinh hầu hết các cơ quan tử (chủ yếu là lục lạp) tụ thành đám quanh nhân (có thể quan sát rõ trên kính hiển vi). Tỷ lệ tái tạo và độ thành thục của thành tế bào trong quá trình nuôi cấy phụ thuộc vào các yếu tố: giai đoạn phân hóa của tế bào trần, điều kiện tách tế bào trần và tính đặc thù của loài thực vật. Quá trình tái tạo thành tế bào diễn ra ngay vài giờ sau khi tách và có thể hoàn thiện sau 2-7 ngày. Sau khi thành tế bào được tái tạo hoàn chỉnh, tế bào trần không còn giữ nguyên hình dạng như ban đầu. (Nguyễn Quang Thạch và cs., 2009). Sự phân chia diễn ra liên tục và tạo thành các cụm đa bào goi là microcallus (những cụm đa bào này là kết quả của sự tái tạo thành và sự phân chia tế bào). Sau 3-8 tuần có thể thu được các marcocallus với kích thước 0,5-1,5mm nằm trên bề mặt thạch. Các marcocallus được cấy chuyển tiếp sang môi trường tái sinh RJM (Möllers and Wenzel, 1992), đặt trong điều kiện nuôi cấy macrocallus. Khoảng 8- 12 tuần sau khi cấy chuyển, marcocallus sẽ tái sinh thể chồi. Các thể chồi được chuyển sang môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962) để tạo cây hoàn chỉnh. Hai đối tượng tế bào đem lai có thể dung hợp thành một tế bào mới một cách tự phát hoặc được cảm ứng bởi tác nhân như hóa chất (dung hợp hóa chất polyethylen glycol, ký hiệu là PEG) hay xung điện (dung hợp xung điện- electrofusion). Đối với cây khoai tây người ta đã sử dụng cả hai phương pháp trên. Tuy nhiên so với phương pháp dung hợp bằng hóa chất, dung hợp xung điện được áp dụng phổ biến và đạt hiệu quả cao hơn hơn do thao tác đơn giản, tốc độ nhanh, hiệu suất dung hợp cao trong cùng một thời điểm và ít gây độc đối với tế bào. Phương pháp dung hợp bằng hóa chất PEG thường gây độc cho tế bào trần do không rửa sạch hết PEG, do vậy sẽ ảnh hưởng đến khả năng tái sinh sau này 5 (Nguyễn Quang Thạch và cs., 2009). Nhìn chung khoảng 20%-25% tế bào trần có thể bị kích thích dung hợp bởi các yếu tố kích thích mặc dù sự hình thành thể nhân có thể là 50-70% (Nguyễn Quang Thạch và cs., 2009). Tuy nhiên, sự nhận biết các thể dị nhân là không đơn giản, cần phải có các phương pháp chọn lọc đặc trung. Việc tách được các cá thể lai heterocariot (dị nhân) ra khỏi các cá thể đồng dung hợp hay chưa dung hợp khi tái sinh là hết sức quan trọng. Trong mục tiêu nghiên cứu lý thuyết, người ta có thể sử dụng cả “bố”, “mẹ” có đặc trưng rất khác nhau để dễ dàng thanh lọc ra các thể lai trên môi trường chọn lọc. Bằng các phương pháp chỉ thị phân tử (AFLP, RAPD, RELP, PCR) hoặc isozyme có thể xác định chính xác các con lai soma mang các gen của cả bố và mẹ dung hợp. 2.4. BỆNH MỐC SƢƠNG TRÊN CÂY KHOAI TÂY Bệnh mốc sương do nấm Phytophthora infestans gây ra là bệnh gây hại nghiêm trọng bậc nhất cho cây khoai tây, đặc biệt bệnh nếu bùng phát thành dịch sẽ rất nguy hiểm ở các vùng chuyên canh. Một nguồn gen kháng mốc sương mới được phát hiện gần đây và hiện đang được tập trung nghiên cứu là các gen kháng có nguồn gốc từ loài khoai tây dại Solanum bulbocastanum. Đây là loài dại nhị bội, có nguồn gốc từ vùng trung Mỹ, phát triển tại vùng đồi núi có độ cao từ 1200 đến 2300 mét so với mực nước biển, thuộc đông bắc Mexico (Spooner et al., 2005). Cho đến nay các nhà khoa học đã phát hiện và nhân dòng được 4 gen kháng bệnh mốc sương có nguồn gốc từ loài dại Solanum bulbocastanum thuộc vùng lặp giàu Leucine (NBS-LRR), bao gồm: Gen Rpi-blb1 (van der Vossen et al., 2003) hay còn được biết đến với tên RB (Song et al., 2003); gen Rpi-blb2 (van der Vossen et al., 2005); gen Rpi- blb3 (Lokosou et al., 2009); gen Rpi-bt1 (Oosumi et al., 2009) được phát hiện từ phép lai giữa S. bulbocastanum và S. tuberosum. 2.5. CÁC PHƢƠNG PHÁP CHỌN TẠO GIỐNG KHOAI TÂY 2.5.1. Chọn tạo giống khoai tây bằng phƣơng pháp truyền thống Các phương pháp chọn tạo khoai tây truyền thống thường được áp dụng như kỹ thuật lai tạo, lai lại (backcross), đột biến và chọn lọc (Kuckuck et al., 1985). Nhược điểm của phương pháp truyền thống là vấp phải những khó khăn về mặt đặc tính di truyền của kỹ thuật trồng trọt (Solanum tubersosum). 2.5.2. Chọn tạo giống khoai tây bằng phƣơng pháp chuyển gen Kỹ thuật chuyển gen trên cây khoai tây đã được ứng dụng để chuyển gen kháng bệnh virus, kháng bệnh mốc sương, bệnh tuyến trùng (root-knot), héo xanh (Verticillium wilt) và rệp. Tuy nhiên phương pháp chuyển gen còn nhiều hạn chế: nhiều tính trạng nông sinh học quan trọng không thể chuyển vào cây trồng bằng công nghệ gen do chúng được kiểm soát bởi đa gen; hoặc các gen kiểm soát các 6 tính trạng mong muốn vẫn chưa được biết đến; nhiều gen rất khó để tách ra được và nhân dòng thành công; ngoài ra do khoai tây là cây lương thực, thực phẩm nên vẫn còn nhiều tranh cãi về sử dụng sản phẩm chuyển gen (GMO). 2.5.3. Chọn tạo giống khoai tây bằng phƣơng pháp dung hợp tế bào trần Đã có nhiều công trình công bố về việc sử dụng nguồn gen khoai tây dại để chuyển vào các giống khoai tây trồng bằng dung hợp tế bào trần và lai hữu tính (Thieme et al., 2010): S. Chacoense (Butenko et al., 1982); S.niggrum (Binding et al., 1982, 1988); S.brevidens (Austin et al., 1985; Helgeson, 1993); S.circaeifolium (Mattheij et al., 1992); S.berthaultii (Serraf et al.,1991); S.commersonii (Cardi et al., 1993); S.khasianum, S.aculeatissimum (Stattmann et al., 1994); S.torvum (Jadari et al., 1992); S.phureja (Puite et al., 1986); S.pinnatisectum (Sidorov et al., 1987, 1994; Schilde-Rentschler et al., 1993; Thieme et al., 1995); S.bulbocastanum (Austin et al., 1993; Brown et al., 1995; Schilde-Rentschler et al., 1993; Thieme et al., 1995). Thieme et al. (1997) đã lai tạo thành công giữa khoai tây trồng S. tuberosum (2n = 2x và 2n = 3x) với 2 loài khoai tây dại nhị bội Mê-xi-cô (S.pinnasisexta và S.bulbocastana) qua dung hợp tế bào trần bằng xung điện. Dinu and Thieme (2000) đã tạo thành công tổ hợp lai giữa các loài khoai tây dại với các giống khoai tây trồng S. tuberosum L., các dòng khoai tây chọn tạo giống và các dòng nhị bội nhằm để chuyển các gen kháng bệnh mốc sương và các gen kháng bệnh virus vào khoai tây trồng. Thieme et al. (2010) cũng đã tạo được các con lai không chỉ đa dạng về hình thái, các tính trạng nông sinh học mà chúng cũng đồng thời kháng được cả bệnh và sâu hại. Để chuyển tính kháng bệnh mốc sương từ loài khoai tây dại Solanum michoacanum (mch) (có khả năng kháng bệnh mốc sương cao) vào khoai tây trồng Solanum tuberosum, các phép lai soma bằng dung hợp tế bào trần đã được áp dụng giữa mch với 2 dòng khoai tây nhị bội DG 81-68 và DG 88-89 và giống khoai tây trồng tứ bội Rynal nhạy cảm với bệnh mốc sương (Smyda et al., 2013). Tiếp nối các nghiên cứu này, Smyda et al. (2016) đã dung chỉ thị DArT (Diversity array technology) để phân tích thành phần genom nhân của 97 con lai soma của tổ hợp lai giữa S.michoacanum với S.tuberosum và 11 con lai cùng loài 4x mch (những con lai có tính kháng bệnh mốc sương). Phân tích cấu trúc nhiễm sắc thể của các con lai đã cho thấy sự có mặt hay không có mặt của các chỉ thị phân tử từ genom của cả bố và mẹ dọc theo chiều dài của nhiễm sắc thể của các con lai soma. Ở Việt Nam, cho đến nay công nghệ này vẫn còn hết sức mới mẻ. Hướng nghiên cứu chọn tạo giống khoai tây lâu nay ở Việt Nam chủ yếu vẫn là công tác nhập nội và khảo nghiệm, trên cơ sở đó đề xuất các giống phù hợp cho sản xuất. Gần đây, nghiên cứu chọn tạo giống khoai tây có sử dụng kỹ thuật dung hợp tế bào trần đã được bắt đầu tiến hành ở Việt Nam (Nguyễn Thị Phương Thảo và cs., 2009, 2011, 2012; Đỗ 7 Thị Thu Hà và cs., 2012, Đinh Thị Thu Lê và cs, 2012, Vũ Thị Thu hằng và cs., 2012). Tiếp tục hướng nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu tạo các con lai soma tổ hợp được đặc tính kháng bệnh mốc sương từ loài dại và các đặc tính nông học quý từ khoai tây trồng. Đây là hướng đi quan trọng để tạo vật liệu khởi đầu cho chương trình chọn tạo giống khoai tây của Việt Nam. PHẦN 3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU Nghiên cứu được tiến hành tại Viện Sinh học nông nghiệp – Học Viện Nông nghiệp Việt Nam và Viện Nghiên cứu chọn tạo giống cây trồng (Viện JKI- CHLB Đức) trong thời gian nghiên cứu từ năm 2011 đến năm 2015. 3.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU Các dòng khoai tây dại kháng bệnh mốc sương: S. bulbocastanum, S. tarnii, S. pinnatisectum thu thập từ Ngân hàng Gen khoai tây quốc tế tại Đức (The Leibniz Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research, IPK, Genebank). Các giống khoai tây trồng mang các tính trạng nông sinh học quý thích nghi với điều kiện khí hậu ở Việt Nam. 3.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 3.3.1. Nội dung 1: Tách và dung hợp tế bào trần giữa các dòng khoai tây dại với các giống khoai tây trồng - Tách tế bào trần của các dòng khoai tây dại và giống khoai tây Atlantic - Dung hợp tế bào trần của các dòng khoai tây dại với các dòng khoai tây trồng thu thập được - Nuôi cấy và tái sinh các tổ hợp lai sau dung hợp 3.3.2. Nội dung 2: Xác định các con lai soma bằng các phƣơng pháp đếm độ bội (Flow cytometry) và bằng chỉ thị phân tử SSR - Xác định các con lai soma bằng phương pháp đếm độ bội Flow cytometry - Xác định các con lai soma bằng chỉ thị phân tử SSR 3.3.3. Nội dung 3: Đánh giá đặc tính kháng bệnh mốc sƣơng của các con lai soma bằng lây nhiễm nhân tạo và bằng chỉ thị phân tử - Đánh giá tính kháng bệnh mốc sương của các con lai soma bằng lây nhiễm nhân tạo và chỉ thị phân tử - Đánh giá các con lai soma về các tính trạng nông sinh học của các con lai soma 3.3.4. Nội dung 4: Lai lại giữa các con lai soma với các giống khoai tây trồng để tạo quần thể chọn lọc - Lai lại giữa các con lai soma với các giống khoai tây trồng - Đánh giá và chọn lọc từ quần thể các con lai BC thu đượ