Tóm tắt Nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý của lợn mắc tiêu chảy thành dịch do virus (Porcin epidemic diareehea - Ped) gây ra trên lợn Mán và lợn rừng tại tỉnh Hà Giang

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN THỊ THƠM NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CỦA LỢN MẮC TIÊU CHẢY THÀNH DỊCH DO VIRUS (PORCIN EPIDEMIC DIAREEHEA - PED) GÂY RA TRÊN LỢN MÁN VÀ LỢN RỪNG TẠI TỈNH HÀ GIANG Chuyên ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi Mã số: 9.64.01.02 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÀ NỘI, NĂM 2019 Công trình hoàn thành tại: HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Ngƣời hƣớng dẫn: 1. PGS.TS. NGUYỄN HỮU NAM 2. PGS.TS. PHẠM HỒNG NGÂN Phản biện 1: GS.TS. Nguyễn Thị Kim Lan Trƣờng Đại học Nông lâm, Đại học Thái Nguyên Phản biện 2: PGS.TS. Chu Đức Thắng Học viện Nông Nghiệp Việt Nam Phản biện 3: PGS.TS. Cù Hữu Phú Hội Thú y Luận án sẽ đƣợc bảo vệ trƣớc Hội đồng đánh giá luận án cấp Học viện họp tại: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Vào hồi giờ, ngày tháng năm 2019 Có thể tìm hiểu luận án tại thƣ viện: - Thƣ viện Quốc gia Việt Nam - Trung tâm Thông tin - Thƣ viện Lƣơng Định Của Học viện Nông nghiệp Việt Nam 1 PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Ngành chăn nuôi lợn ở Hà Giang ngày càng chiếm một vị trí quan trọng trong sản xuất nông nghiệp của tỉnh và nhanh chóng chuyển đổi thành sản xuất hàng hoá. Cùng với trào lưu đó, hiện nay ở Hà Giang đang có xu thế phát triển chăn nuôi lợn Mán và lợn Rừng theo mô hình trang trại và bước đầu đã cho kết quả khả quan. Ở Hà Giang, hiện nay những thông tin và hiểu biết về PED của người quản lý và người chăn nuôi còn rất hạn chế, chưa có công bố chính thức nào về tình hình nhiễm PEDV tại tỉnh. Trước thực trạng đó, nhằm hiểu rõ hơn về đặc điểm bệnh lý của bệnh tiêu chảy thành dịch (PED) gây ra cho đàn lợn Mán, lợn Rừng tại tỉnh Hà Giang. Đồng thời có thêm cơ sở khoa học cho việc chủ động xây dựng các biện pháp trong công t c phòng ngừa sự x m nh p của virus ED trên lợn Mán và lợn Rừng tại tỉnh Hà Giang, cũng như c c tỉnh miền núi phía BắcViệt Nam. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài này. 1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 1.2.1. Mục tiêu chung Mục tiêu của lu n án nhằm x c định c c đặc điểm bệnh lý chủ yếu ở lợn Mán và lợn Rừng mắc PED. Để làm căn cứ trong chẩn đo n l m sàng và chẩn đo n ph n biệt với các nguyên nhân gây tiêu chảy khác. 1.2.2. Mục tiêu cụ thể - X c định tỷ lệ lợn Mán, lợn Rừng mắc tiêu chảy thành dịch (PED) trong các trang trại nuôi lợn Mán và lợn Rừng điển hình của tỉnh Hà Giang; - X c định rõ các biểu hiện lâm sàng và bệnh tích (đại thể và vi thể) chủ yếu của (PED); - X c định được sự thay đổi một số chỉ tiêu huyết học ở lợn mắc (PED). 1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU 1.3.1. Đối tƣợng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: Lợn Mán và lợn Rừng mắc tiêu chảy và mắc tiêu chảy thành dịch (PED) tại các trang trại và gia trại điển hình của tỉnh Hà Giang. 1.3.2. Phạm vi nghiên cứu - Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ sinh học. - Phòng thí nghiệm Bộ môn Bệnh lý Thú y (làm tiêu bản bệnh lý), Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam. - Địa điểm theo dõi và lấy mẫu: Tại các trang trại và gia trại nuôi lợn Mán và lợn Rừng tại tỉnh Hà Giang. - Thời gian nghiên cứu: Thời gian nghiên cứu và số liệu của đề tài được thu th p từ th ng 12/2014 đến tháng 8/2017. 1.4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI - X c định được c c đặc điểm bệnh lý chủ yếu của lợn Mán và lợn Rừng mắc PED tại tỉnh Hà Giang; 2 - hương ph p hóa mô miễn dịch đã x c định được sự hiện diện của virus porcine epidemic diarrhea trong các mô của lợn Rừng mắc PED; - Cung cấp các thông tin về chỉ tiêu huyết học của lợn Rừng trong chăn nuôi trang trại. 1.5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 1.5.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài Đ y là nghiên cứu về PED trên lợn Mán và lợn Rừng tại tỉnh Hà Giang Việt Nam. Cùng với việc phát triển nuôi lợn Mán và lợn Rừng như hiện nay, nhất thiết phải có nhiều nghiên cứu về dịch bệnh để có biện pháp phòng ngừa và phát triển bền vững đối tượng nuôi này. Do v y, kết quả nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng cho các nhà quản lý chăn nuôi, c c nhà thú y và người nuôi trong việc sàng lọc và nhân giống lợn Mán, lợn Rừng. Bảo vệ đàn lợn Mán, lợn Rừng và đề ra chiến lược phát triển phù hợp giúp người nuôi an tâm sản xuất và phát triển kinh tế, đặc biệt là tại các tỉnh miền núi phía Bắc ở Việt Nam. - Kết quả của lu n án chỉ ra được những đặc điểm bệnh lý của lợn Mán và lợn Rừng mắc PED, c c thông tin có ý nghĩa quan trọng trong công tác chẩn đo n lâm sàng và chẩn đo n ph n biệt các bệnh tiêu chảy trên lợn Mán và lợn Rừng. - Lu n án làm tài liệu tốt cho việc tham khảo giảng dạy và nghiên cứu về PED trên lợn Mán và lợn Rừng ở c c trường, viện chuyên ngành. 1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài - ết quả nghiên cứu đã khẳng định lợn Mán và lợn Rừng nuôi tại tỉnh Hà Giang có thể mắc PED và đã làm rõ các đặc điểm bệnh lý chủ yếu của lợn Mán và lợn Rừng mắc PED. Là tài liệu tham khảo hữu ích cho các cán bộ thú y, người chăn nuôi có thể bước đầu chẩn đo n x c định bệnh để có biện pháp can thiệp kịp thời giảm thiểu các thiệt hại kinh tế. - ết quả nghiên cứu có thể được s dụng làm tiền đề để tiếp tục nghiên cứu về virus PED, là tiền đề cho việc nghiên cứu tiếp theo. PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. TÌNH HÌNH CHĂN NUÔI LỢN Ở HÀ GIANG Ngành chăn nuôi lợn ở Hà Giang ngày càng chiếm một vị trí quan trọng, trong sản xuất nông nghiệp của tỉnh và nhanh chóng chuyển đổi thành sản xuất hàng hoá. Cùng với trào lưu đó, hiện nay ở Hà Giang đang có xu thế phát triển chăn nuôi lợn Mán và lợn Rừng theo mô hình trang trại và bước đầu đã cho kết quả khả quan. 2.1.1. Giống lợn Mán (hay còn gọi là lợn địa phƣơng, bản địa) Lợn Mán thuộc lớp động v t có vú (Mammalia), bộ guốc chẵn (Articodactyla), họ Suidae, chủng Sus, loài Sus domesticus. Lợn Mán là giống lợn được nuôi phổ biến trong làng bản đồng bào các dân tộc Dao, Nùng, Tày, Mông, ở Hà Giang. Số lượng ước tính khoảng trên 50.000 con lợn trưởng thành đang được nuôi rải rác trong các làng bản vùng sâu, vùng xa. Lợn Mán 3 có hình dáng rất gần với lợn Rừng, tầm vóc nhỏ, mõm dài, hơi nhọn và chắc, thích hợp cho việc đào bới tìm kiếm thức ăn. Da dày, mốc, lông đen dài, có bờm dài và dựng đứng, chân nhỏ, đi bằng móng và rất nhanh nhẹn, thích nghi với việc thả rông, tự tìm kiếm thức ăn. Tốc độ sinh trưởng ch m và phụ thuộc vào nguồn thức ăn. Lợn này có màu lông đen, hung, n u. Trong phạm vi Dự n Biodiva đã đ nh gi sự đa dạng trên 1053 mẫu của quần thể lợn tỉnh Hà Giang. Nguyễn Thiện (2006), Nhà xuất bản Lao động - Xã hội 2.1.2. Giống lợn Rừng Lợn Rừng là loài v t mới nuôi phổ biến hiện nay ở nhiều tỉnh trong cả nước, bởi phẩm chất thịt thơm ngon, gần như không có mỡ, ít cholesteron và đặc biệt có da dày, giòn ng y. Phong trào nuôi lợn Rừng ngày càng lan rộng do đó gi thịt hơi kh hấp dẫn (luôn giữ giá 100.000 đ/kg) và nhu cầu tiêu dùng ngày càng tăng mạnh. Lợn Rừng (wild pig) vốn chính là thủy tổ của các giống lợn hiện nay. Theo phân loại động v t thì lợn Rừng thuộc giới động v t (Amimalia), ngành dây sống (Chordata), ph n ngành có xương sống (Vertebarata), nhóm động v t có hàm (Gnathosomata), lớp có vú (Mamalia), phân lớp thú cao hay thú có nhau (Eutheria), bộ guốc chẵn (Artiodactyla), họ lợn (Sus), loài lợn Rừng (Sus Serofa) (Võ Văn Sự, 2009; Đào Lệ Hằng, 2008). 2.2. NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ TIÊU CHẢY Tiêu chảy là biểu hiện lâm sàng của quá trình bệnh lý đặc thù ở đường tiêu hóa. Tùy theo yếu tố nào được xem là nguyên nh n chính mà nó được gọi với nhiều tên khác nhau: Bệnh lợn con ỉa phân trắng, bệnh tiêu chảy sau cai sữa, chứng khó tiêu, chứng rối loạn tiêu hóa hay Colibacillosis, Salmonellosis, hoặc tiêu chảy là triệu chứng thường gặp ở nhiều bệnh ký sinh trùng, bệnh do virus, bệnh do vi khuẩn. 2.2.1. Nghiên cứu tiêu chảy thành dịch ở lợn (PED) trên thế giới Bệnh tiêu chảy thành dịch hay còn gọi là dịch tiêu chảy cấp ở lợn (Porcine Epidemic Diarrhea - PED) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm do một loại virus thuộc giống Alphacoronavirus, họ Coronaviridae gây ra. Dịch ED thường xảy ra ở lợn con dưới 7 ngày tuổi với tỷ lệ ốm và tỷ lệ chết có thể lên đến 100%. Dịch ED đã và đang g y thiệt hại kinh tế nghiêm trọng đối với ngành chăn nuôi lợn ở nhiều quốc gia trên thế giới (Lee, 2015). Dịch PED lần đầu tiên được phát hiện ở Anh vào năm 1971, sau đó c c ổ dịch liên tục được phát hiện và xảy ra phổ biến ở các quốc gia ch u Âu kh c như Bỉ, Đức, Pháp, Hà Lan, Thụy Sỹ, và ở ch u Á như Trung Quốc, Hàn Quốc, Nh t Bản, Thái Lan (Chen et al., 2013). Ở Việt Nam, dịch PED lần đầu tiên được phát hiện vào năm 2008 và từ đó đến nay dịch bệnh thường xuyên xảy ra và gây ra ảnh hưởng nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi. Hiện nay, PED ngày càng xuất hiện phổ biến ở các quốc gia ch u Á, đặc biệt PED ngày càng trở nên cấp tính và nghiêm trọng hơn (Song and ark, 2012). Ở Trung Quốc, trường hợp nhiễm EDV đầu tiên được phát hiện năm 4 1973, sau hơn hai th p kỷ s dụng vaccine vô hoạt nhũ dầu, sự xuất hiện trở lại của EDV tương đối ít. Tuy nhiên đến năm 2010, bệnh đã xuất hiện trở lại và bùng phát ngày càng trầm trọng ở các tỉnh có sự phát triển ngành chăn nuôi lợn. Từ th ng 2 năm 2010 đến th ng 11 năm 2011, tỷ lệ lợn chết từ 90 tới 100% (tương ứng 50.000 con), chủ yếu là lợn dưới 7 ngày tuổi (Chen et al., 2013). Ở Nh t, dịch PED xuất hiện lần đầu tiên năm 1993, g y chết 14.000 con, tỉ lệ chết từ 30 tới 100% lợn con, dịch ED năm 1996 gây chết 39.509 con. Ở Hàn Quốc, dịch PED xuất hiện đầu tiên năm 1992, sau đó đến năm 2007-2008, dịch liên tiếp xuất hiện ở các Quốc gia Ðông Nam Á như Thái Lan, Philippines và Việt Nam. Trong thời gian cuối năm 2007 - 2008, tại Thái Lan, dịch phát hiện đầu tiên ở tỉnh Nakornpathom trước khi nó lan rộng trong cả nước. Dịch lan rộng đã g y thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi lợn của Thái Lan. Phân tích cây phát sinh loài, thấy tất cả các PEDV phân l p được trong thời gian bùng phát dịch đều giống chủng ở Trung Quốc JS - 2004 - 2 (Puranaveja et al., 2009). 2.2.2. Nghiên cứu về tiêu chảy thành dịch (PED) ở lợn tại Việt Nam Năm 2008, EDV đã được phát hiện trong một số đàn lợn mắc tiêu chảy ở Việt Nam. Trong năm 2008 - 2009, bệnh lan rộng nhanh chóng ở các tỉnh miền Đông Nam Bộ gây ảnh hưởng lớn đến ngành chăn nuôi lợn nước ta. Bệnh xảy ra rất nhanh, trên toàn đàn lợn và gây chết gần như 100% lợn con theo mẹ. Tỷ lệ t vong trên đàn lợn giữa các tỉnh dao động từ 65 - 91%. Theo nh n định của các chuyên gia thì nguyên nhân của tiêu chảy cấp có thể là do bệnh tiêu chảy thành dịch ở lợn (PED) hoặc do viêm dạ dày ruột truyền nhiễm (TGE) g y ra. Năm 2010, dịch vẫn tiếp tục xảy ra ở một số trại, th m chí tái phát ở những trại đã từng xảy ra dịch trong năm 2009. Theo thống kê của phòng xét nghiệm nhanh công ty C.P Việt Nam trong 5 th ng đầu năm 2010 cả nước có 31 trại bị nhiễm PED và tỉnh có nhiều ca bệnh nhất là Đồng Nai với 15 ca bệnh. Các trại bị nhiễm bệnh này chủ yếu t p trung ở miền Nam (Đồng Nai, L m Đồng, Bà Rịa - Vũng Tàu, Bình hước, Củ Chi). Ở miền Bắc, theo báo cáo không chính thức các công ty, trang trại tại Hải Dương, Th i Nguyên, Bắc Ninh, Bắc Giang, Hưng Yên, Th i Bình, Hà Nam, Nam Định, Hòa Bình, dịch tiêu chảy do EDV đã xảy ra nghiêm trọng từ đầu năm 2010 và cho đến nay tình hình dịch bệnh tại các tỉnh phía Bắc Việt Nam ngày càng trầm trong hơn. C c nghiên cứu trước đó tại Viện Thú y Quốc gia, Trung tâm chẩn đo n Thú y TW, hòng thí nghiệm trọng điểm CNSH Thú y - Học Viện Nông nghiệp Việt Nam đã x c định được các ca nhiễm PED trên lợn ở phía Bắc Việt Nam. Ở Việt Nam, hiện tại có rất ít nghiên cứu tiến hành về tiêu chảy thành dịch ở lợn (PED). Theo Do Tien Duy et al. (2011); Nguyễn Tất Toàn (2012), bệnh được phát hiện ở Việt Nam từ năm 2008. Sau đó, bệnh ngày càng lan rộng và bùng phát ở nhiều khu vực. Bệnh gây thiệt hại nặng nề cho các trang trại bởi tỉ 5 lệ mắc toàn đàn rất cao (gần 100%). Theo thống kê không chính thức của phòng xét nghiệm nhanh công ty CP Việt Nam trong năm th ng đầu năm 2010 cả nước có 31 trại bị nhiễm PED. Các trại bị nhiễm bệnh này chủ yếu t p trung ở các tỉnh nam bộ như Đồng Nai, L m Đồng, Bình hước, Bà Rịa - Vũng Tàu. Ở khu vực phía Bắc, các nghiên cứu đã x c định được bệnh tiêu chảy thành dịch trên lợn (Porcine epidemic diarrhea - viết tắt: PED) xảy ra tại 26 trại ở 6 tỉnh, trong đó một số trại cộng nhiễm cả virus TGE và virus Rota. Tại các trại, ED thường bùng phát vào mùa lạnh (từ th ng 11 đến tháng 4), thời gian l y lan nhanh, thường xảy ra đầu tiên trên đàn lợn nái, tỷ lệ lợn biểu hiện tiêu chảy cao (trung bình 76,8%). Lợn ở tất cả các lứa tuổi đều bị tiêu chảy (có thể lên tới 100%), tỷ lệ chết cao ở lợn con theo mẹ (68,6%). Có sự khác biệt lớn về mức độ cảm nhiễm, tỷ lệ biểu hiện tiêu chảy, tỷ lệ chết, thời gian tiêu chảy giữa các trại và giữa các nhóm tuổi, giới tính. Triệu chứng chủ yếu ở lợn mắc PED là tiêu chảy, nôn m a, bỏ ăn, kèm theo c c rối loạn về hô hấp, thần kinh, mức độ trầm trọng tăng dần theo tuổi. Bệnh tích đại thể ở lợn con thường gặp là thành ruột non mỏng, căng phồng toàn bộ hoặc từng đoạn (61,3 - 94%); dạ dày sung huyết, xuất huyết (19,4 - 84%); hạch lympho màng treo ruột, gan sung huyết, ứ huyết; tĩnh mạch màng treo ruột sung huyết nặng, khó quan sát thấy mạch bạch huyết ở màng treo ruột. Bệnh tích vi thể chủ yếu đường tiêu hóa: lông nhung đứt nát, ngắn lại; tế bào biểu mô hấp thu thoái hóa không bào; biểu mô phủ dạ dày, ruột bong tróc; sung huyết, xuất huyết, thâm nhiễm tế bào viêm ở lớp đệm và lớp hạ niêm mạc đường tiêu hóa (Nguyễn Văn Điệp và cs., 2014). Kết quả xét nghiệm bằng kỹ thu t RT- CR đã chỉ ra được các lợn có biểu hiện triệu chứng lâm sàng, bệnh tích như trên đều mắc PED (Nguyễn Văn Điệp và cs., 2014). Mẫu bệnh phẩm được lấy từ phân, ruột và hạch ruột có thể dùng để chẩn đo n ED bằng kỹ thu t RT-PCR cho kết quả tốt. Bệnh tiêu chảy do virus ED g y ra có tính l y lan nhanh tuy nhiên chưa có loại vacxin nào phòng bệnh thì nguy cơ t i ph t, nguy cơ biến chủng của virus cũng là vấn đề rất đ ng lo ngại. Trước tình hình đó, việc hiểu biết về đặc điểm căn bệnh và chẩn đo n nhanh là hết sức cấp thiết trong phòng chống dịch bệnh, bảo vệ sức khỏe v t nuôi và kinh tế cho người chăn nuôi. PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. TRANG THIẾT BỊ, DỤNG CỤ VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU * Vật liệu Từ c c đàn lợn có triệu chứng tiêu chảy đặc trưng do virus, mẫu bệnh phẩm được lấy là ph n, ruột, hạch ruột của lợn nghi mắc tiêu chảy cấp ED, được thu th p bảo quản trong c c ống chứa mẫu đã được vô trùng. C c mẫu bệnh phẩm này sau đó được dùng chẩn đo n ED bằng test chẩn đo n nhanh hoặc phản ứng RT- CR với c c cặp mồi đặc hiệu để chẩn đo n bệnh ED. 6 Chỉ c c mẫu dương tính với EDV mới được lựa chọn cho qu trình nghiên cứu tiếp theo. Các mẫu máu của 60 con lợn đã được chẩn đo n dương tính với virus PED bằng kít PED-Ag test từ một số trại lợn tại Hà Giang và của 60 lợn khỏe cùng giống làm đối chứng. Xác chết của 26 con lợn Rừng và 27 con lợn M n được chẩn đo n dương tính với virus PED bằng phương ph p RT-PCR. Kháng thể kháng virus PED từ Viện Thú Y Nh t Bản, kháng kháng thể chứa enzyme bắt màu cơ chất, và một số hóa chất khác s dụng trong HMMD, làm tiêu bản vi thể. * Hóa chất Formol trung tính 10%. Nước cất, cồn, xylen, parafin, thuốc nhuộm heamatoxylin, eosin... Kit tách chiết QIAamp Viral RNA Minikit (Qiagen), Primers. Hóa chất: Môi trường dùng để bảo quản mẫu bệnh phẩm: Formol 10%. Hóa chất dùng để nhuộm tiêu bản: nước cất, cồn ở các nồng độ, xylen, paraffin nấu với. - Máy móc, thiết bị được s dụng trong nghiên cứu: Tủ lạnh, tủ sấy, tủ ấm 37ºC, tủ ấm 56ºC, m y đúc Block, khuôn đúc, m y cắt mảnh Microtom, kính hiển vi quang học, máy li tâm. - Dụng cụ: ipet (Eppendorf), đầu típ các loại (Corning) ống ly tâm 15ml, 50ml (corning). đèn cồn, xi lanh, kim lấy m u, đũa thủy tinh, ống nghiệm. - Dụng cụ mổ khám gia cầm gồm: kéo (kéo cắt da, cơ và cắt xương), kẹp... vòng vớt, lam kính, la men, dao, pank, kẹp, cốc đựng hóa chất. - Trang bị bảo hộ cho người mổ kh m: găng tay và khẩu trang, áo blouse. 3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 3.2.1. Khảo sát tỷ lệ mắc, tỷ lệ chết do tiêu chảy trên lợn Mán lợn và Rừng tại tỉnh Hà Giang - X c định tỷ lệ mắc tiêu chảy trên lợn M n và lợn Rừng tại tỉnh Hà Giang; - X c định tỷ lệ lợn chết do mắc tiêu chảy trên lợn M n và lợn Rừng tại tỉnh Hà Giang. 3.2.2. Xác định tỷ lệ mắc PEDV trên lợn Mán lợn và Rừng trong các đàn lợn bị tiêu chảy tại tỉnh Hà Giang - X c định tỷ lệ lợn mắc ED bằng kít chẩn đo n nhanh EDV -Ag test; - X c định tỷ lệ lợn mắc ED bằng phản ứng RT – PCR. 3.2.3. Xác định triệu chứng lâm sàng và bệnh tích chủ yếu trên lợn Mán lợn và Rừng mắc PED - X c định triệu chứng l m sàng chủ yếu trên lợn M n và lợn Rừng mắc PED; - X c định bệnh tích chủ yếu trên lợn M n và lợn Rừng mắc ED. 3.2.4. Xác định biến đổi bệnh lý vi thể một số cơ quan trên lợn mắc PED và áp dụng phƣơng pháp hóa mô miễn dịch để xác định sự có mặt của virus trong các mô của lợn bệnh - Nghiên cứu biến đổi bệnh lý vi thể của dạ dày, t tràng, không tràng, hồi tràng, kết tràng, hạch màng treo ruột, l ch, gan, th n, phổi, tim của lợn mắc ED; 7 - Áp dụng phương ph p hóa mô miễn dịch để x c định sự có mặt của virus trong c c mô của lợn bệnh. 3.2.5. Xác định một số chỉ tiêu huyết học cơ bản trên lợn Mán và lợn Rừng mắc PED - X c định c c chỉ số hồng cầu của lợn M n và lợn Rừng mắc ED; - X c định c c chỉ số bạch cầu của lợn M n và lợn Rừng mắc ED; - X c định c c chỉ số sinh hóa m u của lợn M n và lợn Rừng mắc ED. 3.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.3.1. Phƣơng pháp điều tra dịch tễ học - Áp dụng c c phương ph p điều tra dịch tễ học thường quy: phỏng vấn trực tiếp, ph t phiếu điều tra, hồi cứu tài liệu lưu trữ, dịch tễ học mô tả; - Triệu chứng l m sàng của lợn mắc tiêu chảy được x c định bằng phương ph p kh m l m sàng thường quy, theo dõi qua c c tiêu chí như trạng th i ph n, thể trạng của lợn. 3.3.2. Phƣơng pháp chẩn đoán bệnh bằng bộ Kít PED-Ag test * Nguyên lý: Bộ kít này dựa trên nguyên lý kỹ thu t sắc ký miễn dịch s dụng phương ph p Direct Sandwich. Hai kh ng thể ( T) đơn dòng trong thiết bị kết hợp đặc thù với c c vùng quyết định kh ng nguyên kh c nhau của kh ng nguyên cần chẩn đo n. Sau khi cho bệnh phẩm thấm vào vị trí đệm cellulose của thiết bị, c c kh ng nguyên của virus ED sẽ di chuyển và kết hợp với hợp chất thể keo màu vàng chứa kh ng thể đơn dòng kh ng virus ED, để tạo thành phức chất „ T- N‟. Sau đó, phức hợp này kết hợp với kh ng thể đơn dòng kh ng virus ED kh c trong màng nitơ-cellulose của thiết bị, để tạo thành phức chất kẹp hoàn chỉnh „ T-KN- T‟ (“Ab-Ag-Ab” direct sandwich). 3.3.3. Phƣơng pháp RT – PCR Sự có mặt của virus ED trên những lợn có biểu hiện tiêu chảy, chưa được tiêm vacxin phòng ED được x c định bằng kỹ thu t RT- CR. RNA được chiết t ch bằng kit QIAamp Viral RNA Minikit (hãng Qiagen), cặp mồi đặc hiệu được thiết kế để khuếch đại một phần gen S, sản phẩm khuếch đại có độ dài 651bp (Park et al., 2008). 3.3.4. Phƣơng pháp mổ khám tiêu chuẩn S dụng phương ph p mổ khám theo tiêu chuẩn trong TCVN 8402: 2010 (Bộ khoa học & Công nghệ, 2010) để tiến hành nghiên cứu tổn thương đại thể và lấy mẫu làm tiêu bản bệnh lý. 3.3.5. Phƣơng pháp làm tiêu bản vi thể Chúng tôi s dụng phương ph p làm tiêu bản vi thể tẩm đúc bằng paraffin theo Robert (1969) và Burn (1974), cắt dán mảnh bằng Microtom. Mỗi lợn bệnh chúng tôi tiến hành lấy mẫu ở mỗi cơ quan hai miếng bệnh phẩm rồi đúc 8 thành một block. Mỗi block chúng tôi tiến hành cắt, nhuộm tiêu bản rồi chọn ra bốn tiêu bản đẹp, sau đó tiến hành soi dưới kính hiển vi để đọc kết quả bệnh tích vi thể. 3.3.6. Phƣơng pháp nhuộm hoá mô miễn dịch hương ph p ho mô miễn dịch s dụng phản ứng T- N đặc hiệu p dụng cho c c mảnh cắt đã chuyển đúc paraffin. C c mảnh cắt sau khi đã kh sạch