Ứng dụng ky thuật pcr genotyping (orf75) trong nghiên cứu tác nhân gây bệnh đốm trắng trên tôm sú (penaeus monodon)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN DIỆP THỊ DIỆU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR GENOTYPING (ORF75) TRONG NGHIÊN CỨU TÁC NHÂN GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version i LỜI CẢM TẠ Xin chân thành cảm tạ Quý Thầy – Cô giảng viên Khoa Thủy Sản, trường Đại học Cần Thơ đã tận tâm giảng dạy, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian em học tập tại trường. Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn cô Trần Thị Tuyết Hoa - Bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy Sản thuộc khoa Thủy Sản – trường Đại Học Cần Thơ đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn em hoàn thành luận văn tốt nghiệp, tạo điều kiện để em có cơ hội học tập và nắm bắt thêm các phương pháp nghiên cứu khoa học. Chân thành cảm ơn các anh, chị ở bộ môn Sinh học và Bệnh thủy sản đã nhiệt tình hỗ trợ, giúp đỡ tận tình trong suốt thời gian thực hiện luận văn. Xin cám ơn các bạn lớp Bệnh học thủy sản khóa 31 đã động viên, giúp đỡ, và trao đổi kiến thức trong suốt thời gian học tập, làm luận văn tốt nghiệp tại Khoa Thủy Sản Xin chân thành cảm ơn và chúc Quý thầy cô và các anh, chị, bạn bè lời chúc sức khỏe và thành đạt. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version ii TÓM TẮT Bệnh do tác nhân là virus gây ra trên tôm đang là một vấn đề nan giải cho nuôi trồng thủy sản Việt Nam và thế giới. Trong đó, bệnh đốm trắng do White spot syndrome virus gây ra là một trong những bệnh nguy hiểm nhất đối với tôm nuôi. Các nghiên cứu về đặc điểm dịch tể của WSSV được thực hiện nhằm đề ra những biện pháp phòng ngừa hiệu qủa nhất để hạn chế đến mức thấp nhất thiệt hại do WSSV gây ra. Và kỹ thuật PCR là một trong những công cụ quan trọng trong nghiên cứu dịch tể học của WSSV. Do vậy đề tài “Ứng dụng kỹ thuật PCR- genotyping (ORF75) trong nghiên cứu tác nhân gây bệnh đốm trắng (White spot syndrome virus – WSSV) trên tôm sú (Penaeus monodon)” được thực hiện. Qui trình PCR genotyping (ORF75) thực hiện với kết quả được ghi nhận: (i) thành phần hóa chất tham gia phản ứng là: PCR buffer nồng độ là 1X, nồng độ MgCl2 là 1,5 mM, nồng độ dNTPs là 200µM, nồng độ mồi xuôi và mồi ngược là 20 pmol, nồng độ taq ADN polymerase là 2 U, nồng độ ADN chiết tách 1 µl. Tổng thể tích cho mỗi phản ứng là 25 µl, (ii) điều kiện phản ứng được thực hiện theo chu kỳ nhiệt là: máy được làm nóng đến 85oC. Sau đó đến giai đoạn 94oC trong 3 phút, 94oC trong 30 giây, 49oC trong 30 giây, 72oC trong 60 giây lặp lại 30 chu kỳ và cuối cùng là 72oC trong 7 phút. Tổng thời gian khuếch đại khoảng 1giờ 20 phút. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version iii MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ .......................................................................................................... i TÓM TẮT ............................................................................................................. ii MỤC LỤC ............................................................................................................ iii DANH SÁCH BẢNG ............................................................................................ v DANH SÁCH HÌNH ............................................................................................ vi CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU .................................................................................... 1 CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ................................................................ 3 2.1 Tình hình nuôi tôm và dịch bệnh trên thế giới ................................................. 3 2.1.1 Tình hình nuôi tôm trên thế giới ................................................................... 3 2.1.2 Tình hình dịch bệnh ở trên thế giới ............................................................... 3 2.2 Tình hình nuôi tôm và dịch bệnh ở nước ta ..................................................... 4 2.2.1 Tình hình nuôi tôm ở Việt Nam .................................................................... 4 2.2.2 Tình hình dịch bệnh ở Việt Nam ................................................................... 6 2.3. Sơ lược về bệnh đốm trắng ............................................................................ 8 2.3.1 Đặc điểm cấu tạo của WSSV ........................................................................ 9 2.3.2 Dấu hiệu bệnh lý ......................................................................................... 10 2.3.3 Loài và giai đoạn cảm nhiễm ...................................................................... 10 2.3.4 Phương thức lây nhiễm .............................................................................. 11 2.3.5 . Một số phương pháp phát hiện WSSV...................................................... 12 2.3.6 Một số kết quả nghiên cứu dịch tể về bệnh đốm trắng ...................... 12 2.4. Kỹ thuật PCR và các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR .......................... 14 2.4.1 Nguyên tắc phản ứng PCR ................................................................... 14 2.4. 2 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR .......................................... 15 2.4.3 Ứng dụng của PCR ............................................................................... 16 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version iv CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................ 18 3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện ...................................................................... 18 3.1.1 Địa điểm ............................................................................................... 18 3.1.2 Thời gian thực hiện .............................................................................. 18 3.2 Vật liệu nghiên cứu .......................................................................................... 18 3.2.2 Hóa chất thí nghiệm ............................................................................. 18 3.2.3 Dụng cụ thí nghiệm .............................................................................. 18 3.3 Phương pháp nghiên cứu ................................................................................. 19 3.3.1 Qui trình phát hiện WSSV ................................................................... 19 3.3.2 Qui trình PCR genotyping (ORF75) .................................................... 20 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN ............................................................... 22 4.1. Ứng dụng qui trình PCR genotyping (ORF75) .............................................. 22 4.2 Chu kỳ nhiệt ..................................................................................................... 23 4.2.1 Chu kỳ phản ứng .................................................................................. 23 4.2.2 Nhiệt độ gắn mồi .................................................................................. 24 4.3 Hàm lượng ADN khuôn .................................................................................. 25 4.4. Nồng độ mồi ................................................................................................... 25 4.5 Nồng độ MgCl2 ................................................................................................ 26 4.6. Nồng độ taq ADN polymerase ....................................................................... 27 4.7 Điều kiện phản ứng .......................................................................................... 28 4.8 Ứng dụng kỹ thuật PCR genotyping sau khi đã tối ưu .................................... 29 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT............................................................ 32 5.1 Kết luận ............................................................................................................ 32 5.2 Đề xuất ............................................................................................................ 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 33 PHỤ LỤC ............................................................................................................. 38 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version v DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1 : Quá trình bộc phát bệnh đốm trắng ở châu Á và châu Mỹ (Escobedo- Bonilla C. M. et al.,2008) ....................................................................................9 Bảng 4.1 Cường độ nhiễm WSSV của các mẫu tôm dùng trong nghiên cứu ...21 Bảng 4.2 : Thành phần hóa chất được sử dụng để ứng dụng ...........................30 Phụ lục 1: Thành phần hóa chât của phản ứng PCR genotyping (ORF75) trước khi tối ưu ............................................................................................................38 Phụ lục 2: Thành phần hóa chất của phản ứng PCR genotyping (ORF75) tối ưu nồng độ taq ........................................................................................................38 Phụ lục 3: Thành phần hóa chất của phản ứng PCR genotyping (ORF75) tối ưu nồng độ mồi 20 pmol .........................................................................................39 Phụ lục 4: Thành phần hóa chất của phản ứng PCR genotyping (ORF75) tối ưu nồng độ mồi 40 pmol .........................................................................................39 Phụ lục 5: Thành phần hóa chất của phản ứng PCR genotyping (ORF75) tối ưu nồng độ mồi 60 pmol .........................................................................................40 Phụ lục 6: Thành phần hóa chất của phản ứng PCR genotyping (ORF75) tối ưu nồng độ MgCl2: ( nồng độ MgCl2 được thực hiện từ 0.5- 5 mM) .....................40 Phụ lục 7: Thành phần hóa chất của phản ứng PCR genotyping (ORF75) tối ưu chu kỳ nhiệt .......................................................................................................41 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version vi DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1 Diện tích nuôi nước lợ qua các năm .................................................... 5 Hình 2.2 Sơ đồ của phản ứng PCR ...................................................................... 16 Hình 4.1: Kết quả 3 mẫu chạy với qui trình PCR genotyping (ORF75 .............. 22 Hình 4.2: Kết quả 10 mẫu chạy với qui trình PCR genotyping (ORF 75) .......... 23 Hình 4.3: Kết quả qui trình PCR genotyping (ORF75) với các nhiệt độ gắn mồi khác nhau ............................................................................................................. 24 Hình 4.4: Kết quả qui trình PCR genotyping (ORF75) với các nồng độ mồi ..... 28 Hình 4.5: Kết quả qui trình PCR genotyping (ORF75) với các nồng độ MgCl2 27 Hình 4.6: Kết quả qui trình PCR genotyping (ORF75) với các nồng độ taq ADN polymerase ........................................................................................................... 28 Hình 4.7: kết quả ba mẫu có cường độ nhiễm khác nhau .................................. 29 Hình 4.8: Kết quả ứng dụng 8 mẫu nhiễm WSSV thu ở Cà Mau ....................... 31 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 1 CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU Việt Nam là một nước có điều kiện tự nhiên rất thuận lợi cho việc phát triển thủy sản. Ngành thuỷ sản là một trong những ngành kinh tế mũi nhọn của quốc gia. Trong những năm gần đây phong trào nuôi tôm ở Việt Nam đã đạt những thành tựu khả quan. Tuy nhiên, song song với việc tăng diện tích nuôi, tăng sản lượng, tăng mức độ thâm canh thì bệnh dịch thủy sản là một mối nguy lớn đối với nghề nuôi trồng thủy sản, đặc biệt là bệnh do virus gây ra đã làm sản lượng tôm giảm một cách đáng kể. Với khả năng lan truyền bệnh và gây chết tôm hàng loạt, bệnh virus đã gây thiệt hại lớn và ảnh hưởng không nhỏ đến nền kinh tế của nhiều quốc gia có nghề nuôi tôm phát triển. Đặc biệt là bệnh đốm trắng (White spot disease-WSD), bệnh đầu vàng (Yellow head disease - YHD), bệnh đỏ đuôi (do Taura syndrome virus- TSV)…. Vì hiện nay bệnh virus trên tôm chưa có thuốc đặc trị, nên công tác phòng ngừa và chẩn đoán bệnh sớm là điều rất cần thiết. Các phương pháp chẩn đoán truyền thống như mô bệnh học hay dựa trên dấu hiệu bệnh lý bên ngoài không giúp phát hiện sớm và chính xác tác nhân gây bệnh. Vì vậy, việc ứng dụng công nghệ sinh học vào trong chẩn đoán bệnh là một bước phát triển giúp người nuôi tôm có những giải pháp kịp thời nhằm làm giảm thiệt hại do virus gây ra. Kỹ thuật PCR là một trong những kỹ thuật chẩn đoán bệnh khá nhạy. Kỹ thuật này không những giúp phát hiện bệnh ở giai đoạn sớm mà còn được dùng như là 1 công cụ để nghiên cứu dịch tể học của bệnh và tác nhân gây bệnh. Qua đó, các phương pháp phòng và trị bệnh được xây dựng để giúp ngươi nuôi hạn chế thiệt hại đến mức thấp nhất do dịch bệnh gây ra và nâng cao năng suất nuôi. Do vậy, đề tài “ứng dụng kỹ thuật PCR genotyping (ORF75) trong nghiên cứu tác nhân gây bệnh đốm trắng trên tôm sú (Penaeus monodon)” được thực hiện. Mục tiêu đề tài Chuẩn hóa qui trình PCR- genotyping (ORF 75) để góp phần vào việc nghiên cứu dịch tể học của tác nhân gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên tôm sú nuôi ở Đồng Bằng Sông Cửu Long. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 2 Nội dung thực hiện Xác định chu kỳ nhiệt, thành phần và nồng độ hóa chất thích hợp cho phản ứng PCR- genotyping (ORF75). Xác định khả năng ứng dụng của qui trình PCR- genotyping (ORF75) sau khi đã tối ưu để phân tích một số mẫu tôm bị nhiễm WSSV. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 3 CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Tình hình nuôi tôm và dịch bệnh trên thế giới 2.1.1 Tình hình nuôi tôm trên thế giới Hiện nay, nghề nuôi tôm biển đã và đang giữ vai trò quan trọng trong nền kinh tế của nhiều nước trên thế giới. Từ những năm 1980 với sự phát triển mạnh mẽ của nghề nuôi tôm biển cả về qui mô và mức độ thâm canh đã làm cho sản lượng tôm tăng vọt. Trong giai đoạn 2000-2003, sản lượng nuôi trồng thủy sản của châu Á hiện chiếm tới 90% về sản lượng và 80% về giá trị nuôi trồng thủy sản của thế giới. Theo thống kê của FAO (2004), hàng năm tỉ lệ tăng trung bình của nuôi trồng thủy sản tính từ năm 1970 đến năm 2002 là 8,9 %. Sản lượng nuôi trồng thủy sản thế giới năm 2002 đạt 51,4 triệu tấn. Trong đó sản lượng tôm đạt khoảng 1,29 triệu tấn (trích dẫn bởi Phạm Minh Đức, 2004). Các loài tôm được nuôi nhiều nhất là tôm sú (Penaeus monodon), tôm thẻ Trung Quốc (Penaeus chinensis) và tôm chân trắng (Penaeus vannamei). Riêng 3 loài tôm này chiếm trên 86% sản lượng tôm nuôi của thế giới. Tôm sú hiện nay được nuôi ở khắp nơi trên thế giới, đặc biệt là ở khu vực Châu Á Thái Bình Dương (chiếm 72%) và Mỹ La Tinh (chiếm 28%). Năm 2003, hai loài tôm sú và tôm thẻ chân trắng chiếm tới 77% tổng sản lượng tôm nuôi (thông tin chuyên đề Bộ Thủy Sản, sô 4/2003) 2.1.2 Tình hình dịch bệnh ở trên thế giới Do việc gia tăng hoạt động nuôi trồng thủy sản đã dẫn tới sự bùng nổ dịch bệnh, bệnh do vi khuẩn và virus trên tôm, gây tổn thất lớn về kinh tế trong ngành thủy sản. Bệnh trên tôm, nhất là bệnh do virus luôn là nỗi lo của người nuôi trồng và là mối quan tâm hàng đầu của các nhà khoa học. Mặc dù virus gây bệnh trên tôm thì không có ảnh hưởng gì đến sức khỏe con người nhưng nó gây tổn thất lớn cho người nuôi tôm. Trong những năm 1980 Đài Loan dẫn đầu thế giới về sản lượng tôm. Nhưng đến 1988 dịch bệnh xảy ra đã làm sụp đổ nghề nuôi tôm của nước này. Còn Indonesia là một nước có nghề nuôi tôm xuất hiện lâu đời nhất ở Châu Á và là một trong những nước dẫn đầu về sản lượng tôm nuôi trong vùng. Tốc độ phát triển của PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 4 nghề nuôi tôm tương đối vững chắc. Nhưng vào năm 1992 dịch bệnh xuất hiện và đã gây thiệt hại khoảng 80% cho các trang trại nuôi tôm thâm canh ở nước này. Cũng như Đài Loan, Trung Quốc là một trong những nước dẫn đầu thế giới về sản lượng tôm nhưng vào năm 1993 bệnh dịch đã làm cho những người nuôi tôm tại Trung Quốc thiệt hại 400 triệu USD; năm 1994 Ấn Ðộ thiệt hại 17,6 triệu USD, năm 1997 nghề nuôi tôm ở Thái Lan thiệt hại 600 triệu USD; năm 1999 bệnh tôm đã làm Ecuađor thiệt hại 280 triệu USD. Theo số liệu thống kê của bộ thủy sản cho thấy sản lượng tôm nuôi trên thế giới giảm từ 676.262 tấn (2001) còn 593.011 tấn (2002) (thông tin chuyên đề Bộ Thủy Sản số 4/2005). Ở khu vực Đông Nam Á - bệnh đốm trắng được xem là nguy hiểm nhất đối với tôm nuôi. Mọi nghiên cứu đều tập trung ngăn ngừa sự lây nhiễm và bùng nổ bệnh đốm trắng ở các ao nuôi. Virus đốm trắng có thể nhiễm vào tôm nuôi từ giai đoạn ấu trùng. Vì vậy, các biện pháp chọn lựa con giống tốt không mang mầm bệnh là một trong những biện pháp góp phần làm hạn chế dịch bệnh (Nguyễn Văn Hảo, 2004). 2.2 Tình hình nuôi tôm và dịch bệnh ở nước ta 2.2.1 Tình hình nuôi tôm ở Việt Nam Việt Nam là một nước có nhiều tiềm năng để phát triển nuôi trồng thuỷ sản ở khắp mọi miền đất nước cả về nuôi biển, nuôi nước lợ và nuôi nước ngọt. Theo điều tra sơ bộ của tổng cục thống kê năm 2007 tổng diện tích mặt nước nuôi trồng thủy sản cả nước là 1008 nghìn ha trong đó diện tích nuôi tôm chiếm 625,6 nghìn ha. Tôm luôn là đối tượng nuôi chủ lực của Việt Nam do giá trị xuất khẩu của chúng cao. Diện tích nuôi tôm ngày càng tăng qua các năm, diện tích tôm nuôi trong năm 2007 tăng gấp 2 lần so với măn 2000. Sự gia tăng diện tích nuôi được biểu hiện qua hình 2.1 (số liệu của tổng cục thống kê, 2007) PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 5 0.0 100.0 200.0 300.0 400.0 500.0 600.0 700.0 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 Năm nghìn ha Hình 2.1: Diện tích nuôi nước lợ qua các năm Trong năm 2007, diện tích nuôi tôm nước lợ chiếm 62% tổng diện tích mặt nước nuôi trồng thủy sản của cả nước, với sản lượng là 386,6 nghìn tấn, chiếm 19% tổng sản lượng nuôi trồng thủy sản cả nước. Theo số liệu của tổng cục thống kê cho thấy ở diện tích và sản lượng tôm nuôi chủ yếu tập trung ở đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL). Trong năm 2007 diện tích nuôi tôm của ĐBSCL chiếm 71% tổng diện tích nuôi tôm của cả nước, với sản lượng là 315.435 tấn, chiếm 82% tổng sản lượng tôm nuôi của cả nước. Các tỉnh có diện tích nuôi tôm nhiều nhất là các tỉnh thuộc ĐBSCL, gồm Cà Mau (279,2 nghìn ha), Bạc Liêu (123,8 nghìn ha), Kiên Giang (103,5 nghìn ha), Sóc Trăng (64,3 nghìn ha), Trà Vinh (48,3 nghìn ha). Song song với việc mở rộng diện tích, sản lượng tôm nuôi cũng tăng mạnh từ 32,7 nghìn tấn (1990) lên đến 386,6 nghìn tấn (2007). Năm 2003 sản lượng tôm của Việt Nam đứng hàng thứ 3 trên thế giới. Các loài tôm nuôi chính ở Việt Nam gồm tôm sú (Penaeus monodon), tôm he mùa (Penaeus merguiensis), tôm nương (Penaeus orientalis), tôm đất/rảo (Metapenaeus ensis), trong đó tôm sú là loài nuôi chủ đạo, đóng góp sản lượng cao nhất (thông tin chuyên đề Bộ Thủy Sản số 2/2005). Theo thông tin do Bộ Thủy sản (2008) đưa ra tại hội nghị tổng kết công tác nuôi trồng thủy sản giai đoạn 2001 – 2005 là: so với năm 1999, sản lượng nuôi trồng thủy sản năm 2005 đã tăng gấp 3 lần (đạt 1,437 triệu tấn); diện tích nuôi trồng tăng 0,83 lần (đạt 959.945 ha); sản lượng tôm sú giống sản xuất trong nước tăng gấp 4 lần (đạt 28,8 tỉ con P15)…Với tổng số vốn đầu tư 13.822 tỉ đồng (ngân PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 6 sách trung ương) giai đoạn 2000 - 2005, nhiều dự án nuôi trồng đã được triển khai mạnh mẽ và có hiệu quả cao tại các địa phương (Quảng Ninh, Thái Bình, Thanh Hoá, Quảng Bình, Trà Vinh…). 2.2.2 Tình hình dịch bệnh ở Việt Nam Trong những năm qua từ 1990- 2007, sản lượng tôm nuôi của nước ta tăng một cách đáng kể. Tuy nhiên do sự phát triển quá ồ ạt của nghề nuôi tôm ven biển còn dẫn đến sự bùng nổ dịch bệnh trên