Xác định hàm lượng độc tố aflatoxin b1 trong bắp và đậu phộng bằng phương pháp sắc kí bản mỏng

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ĐỘC TỐ AFLATOXIN B1 TRONG BẮP VÀ ĐẬU PHỘNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ BẢN MỎNG GVHD: Th.S Lâm Thanh Hiền Thực hiện: Huỳnh Minh Duy, Nguyễn Văn Phú Khoa Công Nghệ Sau Thu Hoạch Sumary : The research of Post-harvest Technology Faculty’s students and teachers have successfully applied the method of Thin Layer Chromotography with two columns: immuno-affinity column and silicagel column to determine Aflatoxin B1 (produced by Aspergillus flavus and Aspergillus paraciticus) on 30 samples (of peanut and corn) at its minimum concentration of 2ppb. This rapid, simple and economic method has served extension work for developing food safety control. I. Đặt vấn đề: Thức ăn gia súc, thực phẩm và các loại hạt có dầu, thảo dược,…đều có khả năng nhiễm độc tố nguy hiểm aflatoxin B1 do 2 loài vi nấm điển hình là Aspergillus flavus (hình 1) và Aspergillus paraciticus gây nên. Các aflatoxin là những tinh thể màu vàng tan trong một số dung môi hữu cơ (clorofoc, methanol, acetone,…) và độc tính cao, rất bền vững với tác nhân hóa lí..., chỉ bị huỷ ở nhiệt độ trên 1200C trong môi trường kiềm. Do cấu trúng hóa học có vòng dihydrofuran (hình 2) nên aflatoxin B1 liên kết với một số enzym làm cản trở trao đổi chất dẫn đến tử vong. Ngoài ra, aflatoxin B1 còn tương tác đồng hóa trị với vật chất di truyền (DNA, RNA) gây tổn thương gan và gây ung thư gan. Với phụ nữ mang thai, hấp thu lượng nhất định sẽ dẫn đến di tật thai nhi hoặc quái thai, nặng có thể chết non. Hình 1: Aspergillus flavus Hình 2: Cấu trúc aflatoxin B1 (C17H12O6) Do đó, việc kiểm tra thực phẩm có nguy cơ nhiễm aflatoxin B1 là rất cần thiết. Theo tiêu chuẩn Việt Nam, thực phẩm dùng cho người lượng aflatoxin không vượt quá 10ppb. Để phát hiện và định lượng aflatoxin, hiện nay 2 nhóm phương pháp chính sau: Nhóm phương pháp hóa lí: sắc kí lớp mỏng, sắc kí lỏng cao áp (HPLC) Nhóm phương pháp miễn dịch học: miễn dịch phóng xạ (RIA), miễn dịch enzym (ELISA) và cột sắc kí ái lực miễn dịch. Đối với phương pháp sắc kí lỏng cao áp, trước khi phát hiện phải trải qua rất nhiều thao tác phức tạp như chiết lấy aflatoxin từ vật liệu, sau đó phải cô đặc trước khi định lượng nên tốn nhiều thời gian thao tác kĩ thuật, hơn nữa thiết bị đầu tư rất đắt tiền. Với phương pháp ELISA, lại có nhiều hạn chế vì aflatoxin thường không bám đặc hiệu vào các giếng polystirene, khoảng phát hiện hẹp, và cần phải có aflatoxin đánh dấu hoặc kháng thể đánh dấu, sai số lớn mặc dù có độ nhạy cao. Vì những lí do đó, chúng tôi tiến hành đề tài: “Xác định hàm lượng độc tố aflatoxin B1 bằng phương pháp sắc kí bản mỏng sử dụng cột ái lực miễn dịch và cột silicagel” trong mẫu hay nhiễm nhất là đậu phộng và bắp với những ưu điểm sau: Cô đặc trên cột với nồng độ thấp và loại bỏ được tạp chất ảnh hưởng đến qui trình định lượng. Thời gian tiến hành nhanh, độ nhạy cao, thiết bị đơn giản và hóa chất ít. II. Vật liệu và phương pháp Nguyên liệu -Bắp hạt và đậu phộng lấy từ chợ Bà Chiểu, Chợ Tân Sơn Nhất. -Bắp hạt và đậu phộng lấy của một số công ty. 2.2. Thiết bị và hóa chất -Thiết bị: + Bột thiết bị chạy sắc kí TLC + Dụng cụ làm khô gia nhiệt, bình thổi khí, đèn soi + Các tấm silicagel 10 x 10 cm mua từ Merk + Microsylinge Halmilton 10µ + Các dụng cụ thủy tinh cần thiết -Hóa chất : acetonlintril, methanol, benzen (tinh khiết) và nước cất + Dung dịch triển khai:
; dung dịch hòa cặn:
+ Aflatoxin B1 chuẩn 0,5ppm trong dung dịch hòa cặn. 2.3. Phương pháp nghiên cứu: 2.3.1. Nơi tiến hành nghiên cứu: Phòng thí nghiệm phân tích hóa sinh, công ty cổ phần giám định và khử trùng FCC. 2.3.2. Tiến trình nghiên cứu:
cột IAC
kết quả IAC Bắp hạt + đậu phộng

sắc ký bản mỏng TLC →
cột silicagel
kếtquả silicagel 2.3.3. Qui trình thực hiện: 2.3.3.1. Sơ đồ phân tích hàm lượng Aflatoxin B1 bằng cột IAC Mẫu phân tích (25gam)
chiết xuất (5g NaCl, 37,5ml nước cất, methanol 87,5ml, thời gian 30 phút)
lọc thường (thu 15 ml và cho thêm 15ml nước cất)
lọc giấy thủy tinh (thu 45ml dịch lọc)
qua cột IAC (2 giọt/phút)
làm khô dịch chiết (trong N2/40 – 500C)
định lượng bằng TLC 2.3.3.2. Sơ đồ phân tích hàm lượng Aflatoxin B1 bằng cột Silicagel -Chuẩn bị cột Silicagel: Sắc ký cột
cho 5gam Na2SO4 khan
cho CHCl3 tới ½ ống
cho 10g silicagel
rửa thành ống 20ml CHCl3
cho từ từ 15gam Na2SO4 khan
cho CHCl3 chảy tới đỉnh Na2SO4 -Tiến hành: Mẫu phân tích (50gam)
chiết xuất (25ml nước cất, 250ml CHCl3, đậy kín và lắc mạnh trong 30 phút)
lọc thường (thu 50 ml)
cột silicagel (đã chuẩn bị)
rửa giải tạp (lần 1: 150ml C6H6, lần 2: 150ml (C2H5)2O)
rửa giải Aflatoxin B1 (150ml CH3OH : CHCl3 = 3:97)
thu dịch Aflatoxin B1 vào bình cầu
làm khô với máy cô quay chân không
hòa cặn (2ml CHCl3)
làm khô (trong N2/40 – 500C hoặc chân không/400C)
định lượng Aflatoxin B1. III. Kết quả và bàn luận 3.1. Tỷ lệ và mức độ nhiễm Aflatoxin B1 trên các mẫu phân tích Bảng 3.1. Hàm lượng Aflatoxin B1 trong các mẫu của khách hành STT  Tên mẫu  Khách hàng  Cột IAC  Cột Silicagel      Hàm lượng Aflatoxin B1 (ppb)   1  Bắp  Cty. Thái Dương  2  không phát hiện   2  Bắp  Phòng Hàng Hải  không phát hiện  không phát hiện   3  Bắp  Phòng Hàng Hải  không phát hiện  không phát hiện   4  Bắp  Cty. Gò Sao  10  7   5  Bắp  FCC Hà Nội  20  14   6  Bắp  Cty. Gò Sao  không phát hiện  không phát hiện   7  Bắp  FCC Hà Nội     8  Bắp  FCC Hà Nội     9  Đậu phộng  Phòng hiện trường     10  Đậu phộng      11  Đậu phộng      12  Đậu phộng      13  Đậu phộng      14  Đậu phộng      15  Đậu phộng      16  Đậu phộng      Nhận xét: theo bảng 3.1, mức độ nhiễm các mẫu đều ≤ 20ppb và cột IAC phát hiện được 3 mẫu và cột silicagel phát hiện được 2 mẫu. Tỉ lệ nhiễm 3/16 mẫu (với cột IAC) và 2/16 mẫu (với cột silicagel) Bảng 3.2. Hàm lượng Aflatoxin B1 trong các mẫu ở chợ Bà Chiểu và Tân Sơn Nhất STT  Tên mẫu  Cột IAC  Cột Silicagel     Hàm lượng Aflatoxin B1 (ppb)   1  Bắp  không phát hiện  không phát hiện   2  Bắp  7  5   3  Bắp  2  không phát hiện   4  Bắp  1  không phát hiện   5  Bắp  không phát hiện  không phát hiện   6  Đậu phộng  4  2,5   7  Đậu phộng  1  không phát hiện   8  Đậu phộng  không phát hiện  không phát hiện   9  Đậu phộng  30  25   10  Đậu phộng  2  không phát hiện   Nhận xét: theo bảng 3.2, mức độ nhiễm các mẫu đều ≤ 20ppb và cột IAC phát hiện được 7 mẫu/10 mẫu và cột silicagel phát hiện được 3 mẫu/10 mẫu. Nhìn chung, mức độ nhiễm trên bắp và đậu phộng ≤ 10ppb. Như vậy, độ nhạy của cột IAC cao hơn so với cột silicagel. So với các mẫu khác hàng, các mẫu thu ở các chợ có nguy cơ nhiễm cao hơn. 3.2. So sánh tỉ lệ phát hiện của cột IAC và cột Silicagel Bảng 3.3. So sánh tỉ lệ phát hiện Aflatoxin B1 của cột IAC và Silicagel Mẫu  Tổng số mẫu  Cột IAC  Cột Silicagel     Số mẫu nhiễm  Tỉ lệ nhiễm (%)  Số mẫu nhiễm  Tỉ lệ nhiễm (%)   Khách hàng  16  3  18,75  2  12,50   Mua chợ  10  7  70,0  3  30,0   Ủ ẩm  4  4  100  4  100   Tổng  30  14  46,67  9  30,0   Nhận xét: theo bảng 3.3, cột có IAC độ nhạy phát hiện tốt hơn cột Silicagel. IV. Kết luận và đề nghị 4.1. Kết luận Trong tổng số 34 mẫu thu nhận và phân tích tại phòng Sinh hóa, Công ty FCC có 30,77% mẫu nhiễm Aflatoxin B1 với mức độ nhiễm ≤ 20ppb và có 10 mẫu nhiễm với mức độ < 50ppb. Độ nhạy phát hiện Aflatoxin B1 của cột IAC cao hơn so với cột Silicagel. Trong 30 mẫu, cột IAC phát hiện 14 mẫu (chiếm 46,67%) và cột silicagel phát hiện được 9 mẫu (chiếm 30%). Cột silicagel không phát hiện được mẫu nhiễm Aflatoxin B1 dưới hàm lượng 2ppb. 4.2. Đề nghị Với phương pháp đơn giản, ít tốn kém và phổ phát hiện nhạy và rộng nên phương pháp dùng cột IAC để phát hiện Aflatoxin B1 trong các sản phẩm và nguyên liệu có dầu là phương pháp tối ưu hiện nay. Hi vọng phương pháp này sớm được áp dụng rộng đặc biệt tại các chợ, các nguồn thu mua nguyên liệu. Phương pháp này chỉ thử nghiệm một số mẫu giới hạn, đề tài này cần được nghiêu cứu thêm các nội dung sau: Khảo sát thêm một số mẫu thuộc các nguồn nguyên liệu khác nhau Khảo sát thêm một số khu vực khác nhau Khảo sát thêm một số mẫu trong các thời điểm khác nhau