Chẩn đoán prrsv bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bào

1  TIỂU LUẬN 2  I. ĐẶT VẤN ĐỀ Trong nhiều năm gần đây, ngành chăn nuôi nước ta ngày càng chiếm vai trò quan trọng trong nền kinh tế vì cơ bản nước ta vẫn là nước Nông nghiệp.Nhưng từ đầu 2007 tới nay, nhà chăn nuôi và người tiêu dùng đang vô cùng hoang mang lo lắng vì đàn heo bị chết do biểu hiện bệnh tai xanh.Và càng ngày bệnh heo tai xanh diễn biến càng phức tạp.Dưới đây là một số thông tin về căn bệnh này. Bệnh tai xanh được ghi nhận lần đầu tiên ở Mỹ vào năm 1987, do chưa xác định được căn bệnh nên gọi là “bệnh bí hiểm” (MD: Mystery Swine). Năm 1992, hội nghi quốc tế về sức khỏe gia súc đã được tổ chức thú y thế giới nhất trí và công nhận bệnh bí hiểm này là Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở heo (PRRS: Porcine reproductive and respiratory syndrome). Bệnh do virus PRRS gây ra, tiến triển phức tạp, khó khống chế lại ít biểu hiện triệu chứng, tỷ lệ mắc bệnh cao, bệnh xảy ra ở mọi lứa tuổi. Bệnh gây sảy thai ở thời kỳ cuối, chậm động dục, gia tăng số thai chết và heo con sơ sinh yếu, heo con chết trước khi sinh, còi cọc, chậm lớn.( “Nhà chăn nuôi cần biết”- Phan Bùi Ngọc Thảo,Phòng Di truyền Giống gia súc-Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam) Dựa vào các triệu chứng lâm sàng và bệnh tích mô tả ở phần trên để chẩn đoán. Trong phòng thí nghiệm, có thể dùng phản ứng Immunoperoxidase một lớp (IPMA) để phát hiện kháng thể 1-2 tuần sau khi nhiễm; phản ứng kháng thể huỳnh quang gián tiếp (IFA) kiểm tra kháng thể IgM trong 5-28 ngày sau khi nhiễm và kiểm tra kháng thể IgG trong 7-14 ngày sau khi nhiễm; phản ứng ELISA phát hiện kháng thể trong vòng 3 tuần sau khi tiếp xúc, tuy nhiên chỉ xác định được tỷ lệ nhiễm.Một phương pháp khác là chẩn đoán bằng nuôi cấy tế bào động vật sau đó dùng RT- PCR để xác định( có thể sử dụng phương pháp nhuộm miễn dịch, hóa miễn dịch), mặc dù việc nuôi cấy phân lập virus trên môi trường tế bào khó, tuy nhiên xác định sự hiện diện của virus từ mẫu huyết thanh dương tính và các mẫu lâm sàng là rất cần thiết để làm cơ sở cho công tác phòng bệnh và các nghiên cứu sau này. (“Nhà chăn nuôi cần biết”- Phan Bùi Ngọc Thảo,Phòng Di truyền Giống gia súc-Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam). II. TỔNG QUAN 1. Tìm hiểu về bệnh do virus PRRS (Porcine reproductive and respiratory syndrome): Khái niệm Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở heo: Là một bệnh do virus gây nên với đặc điểm: - Gây chứng ăn không ngon, khó thở, sốt, sảy thai và chậm lên giống trở lại cùng với sự tăng số heo chết lúc sinh, tăng số heo con chết trước khi cai sữa. - Gây nên hô hấp khó khăn, chậm tăng trưởng và tăng tỷ lệ heo cai sữa chết (trên những đàn mắc bệnh mãn tính). 1.1. Lịch sử căn bệnh: Năm 1987, bệnh được phát hiện lần đầu tiên ở Mỹ với tên gọi “bệnh thần bí trên heo” (Mystery Swine Disease - MSD). 3  Tháng 11 năm 1990, ổ dịch PRRS đầu tiên xảy ra ở Đức và lan tràn nhanh chóng sang các quốc gia khác ở Châu Âu. Mùa đông năm 1990- 1991, lần lượt các quốc gia Châu Âu như Hà Lan, Bỉ, Pháp và Tây Ban Nha đã báo cáo về hội chứng này với nhiều tên gọi khác nhau: “Bệnh tai xanh” (Blue-eared Pig Disease), “Hội chứng hô hấp và sảy thai trên heo” ( Porcine Epidemic Abortion and Respiratory Syndrome -PEARS), hay “Hội chứng hô hấp và vô sinh” (Swine Infertility and Respiratory Disease - SIRD). Năm 1991, lần đầu tiên Wenvoort và cộng sự đã phân lập được căn bệnh ở Viện thú y trung ương Lelytad – Hà Lan đã phân lập được căn bệnh và đặt tên cho loại virus này là “Lelystad”. Năm 1992, Collins và cộng sự ở Mỹ cũng báo cáo về việc phân lập được virus gây bệnh và sử dụng tên gọi VR-2332 để chỉ các chủng phân lập ở Bắc Mỹ. Cũng trong năm 1992, hội nghị quốc tế và tổ chức dịch tễ thế giới (OIE) đã nhất trí đặt tên cho bệnh này là “Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo” (porcine reproductive and respiratory syndrome- PRRS) (Võ Thị Đan Thanh, 2006) Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện vào năm 1997 trên đàn lợn nhập từ Mỹ (10/51 con có huyết thanh dương tính). Các nghiên cứu về bệnh trên những trại giống lớn tại các tỉnh phía Nam cho thấy tỷ lệ lợn có huyết thanh dương tính với bệnh rất khác nhau, từ 1,3% cho tới 68,29%. Ở các nước khác, tỷ lệ đàn trong vùng bệnh có huyết thanh dương tính rất cao, như ở Anh là 6-75%, Mỹ là 36%,… (Phòng Dịch tễ-Cục Thú y) 1.2. Đặc điểm hình thái cấu trúc: 1.2.1. Phân loại Virus PRRS thuộc: Bộ Nidovirales. Họ Arteriviridae. Giống Arterivirus. Hình 2.1. Virus PRRS (Nguồn: http//www. agraroldal.hu) 1.2.2. Đặc điểm hình thái: Virus PRRS có cấu trúc RNA mạch đơn dương, có đường kính 40-70 nm, có vỏ bọc, kích thước genome dài 14,5 kb mã hoá cho việc tái tạo virus (Jeong-Ki Kim và cs, 2005). 1.2.3. Đặc điểm cấu trúc: 4  Virus structure Genome PRRSV Bộ gene của virus PRRS gồm có 8 khung độc mở (ORFs) mã hoá cho các thành phần khác nhau của virus. Tuy nhiên chỉ có 3 khung ORFs có ý nghĩa quan trọng trong định danh virus, đó là ORFs 7,6 và 5 quy định tổng hợp các protein tương ứng: nucleocapsid (N) 15-kDa, matrix (M) 19-kDa và glycoproteins envelope (protein GP5) 25-kDa. Đây là những protein cấu trúc quan trọng nhất, chúng chiếm 90-95% lượng protein cấu trúc của virus. • Protein N là một protein nhỏ (15 kDa) và có tính kiềm cao, điều này có thể giúp nó tương tác dễ dàng hơn với bộ gen RNA. Protein N hiện diện ở mức độ cao trong những tế bào bị nhiễm virus PRRS và chiếm từ 20- 40% lượng protein của phân tử virus. Hiện nay protein N được dùng như là một kháng nguyên để phát hiện kháng thể trong huyết thanh của heo. • Protein M có trọng lượng phân tử khoảng 18 kDa. Mặc dù chức năng của nó được biết rất ít nhưng nó được xem như có vai trò trong sự kết hợp với thụ thể trên tế bào đích, vì protein M kết hợp GP5 tạo phức hợp M-GP5 để kết hợp với thụ thể trên tế bào đích (Delputte và cs, 2001). • Protein GP5 có trọng lượng phân tử khoảng 25 kDA, là nguyên nhân gây ra hiện tượng apoptosis và đóng vai trò quan trọng trong việc nhận diện thụ thể trên tế bào đích (Nathalie và cs, 2003). Về mặt di truyền, khi phân tích gene của các dòng virus PRRS gây bệnh khác nhau, người ta xác định được 2 dòng virus riêng biệt: dòng Châu Âu (Lelystad) và dòng Châu Mỹ (VR-2332). Hai dòng virus này không những khác biệt về đặc tính gây bệnh mà khác nhau về mức độ nhất định về kiểu gene. Qua phân tích gene và theo dõi sự thay đổi trình tự Nu của các dòng PRRS, người ta đã xác định rằng ở dòng Châu Mỹ, các ORFs 7 và 6 có tính ổn định rất cao, chúng gần như không thay đổi trong suốt quá trình tiến hoá của dòng virus này, tuy nhiên, sự khác biệt giữa dòng virus Châu Âu và Châu Mỹ ở 2 khung đọc mở này là rất rõ, chẳng hạn sự tương đồng về trình tự axit amin của ORFs 7 giữa 2 dòng virus này chỉ vào khoảng 57-59% và của ORFs 6 là 70-81%. Trong khi đó, khung đọc mở ORFs 5 lại biến đổi nhiều giữa các chủng trong cùng 1 dòng Châu Mỹ và chỉ tương đồng với dòng Châu Âu khoảng 51-59%. Sự tương đồng về trình tự axit amin quy định do các khung đọc mở ORFs 2, 3 và 4 giữa các dòng Châu Mỹ và Châu Âu tương ứng chỉ ở từ 63,58% và 68% (Nguyễn Ngọc Hải, 2007). 5  Nghiên cứu virus ở mức độ phân tử còn cho phép xác định được khả năng sản xuất và sử dụng virus nhược độc để làm văcxin. Người ta đã ghi nhận nhiều trường hợp hội chứng PRRS trở nên trầm trọng hơn sau khi đàn heo được tiêm vắcxin virus PRRS nhược độc vì cấu trúc gene của virus nhược độc thay thế glycine bằng arginine ở vị trí 151 của ORFs 5 sẽ hoàn nguyên rất nhanh bộ gene của chúng so với bộ gene của virus nguyên thuỷ ngay sau khi xâm nhập vào cơ thể vật chủ, và như thế độc lực của chúng cũng được phục hồi (Nguyễn Ngọc Hải, 2007). 1.3. Dịch tễ học: 1.3.1. Cơ chế sinh bệnh: 6  1.3.2. Tác nhân gây bệnh: Bình thường, đại thực bào sẽ tiêu diệt tất cả vi khuẩn, virus xâm nhập vào cơ thể, riêng đối với virus PRRS, virus có thể nhân lên trong đại thực bào, sau đó phá huỷ và giết chết đại thực bào (tới 40%) phòng Dịch tễ-cục Thú y).. Đại thực bào bị giết sẽ làm giảm chức năng của hệ thống bảo vệ cơ thể và làm tăng nguy cơ bị nhiễm các bệnh kế phát. Virus xâm nhập vào tế bào bằng con đường nhập nội bào (endocytosis) qua trung gian receptor. Người ta đã xác định heparan sulfate là thụ thể của đại thực bào phế nang đối với virus(Delputte và cs, 2001; Nathalie và cs, 2003) và trên MARC-145 là vimentin, vimentin là một yếu tố quan trọng trong việc làm ổn định cấu trúc của tế bào chất trong nhiều loại tế bào khác nhau (Jeong-Ki Kim và cs, 2005). Theo Jeong-Ki Kim và cs, 2005 thì kháng thể kháng vimentin ngăn cản sự gây nhiễm của virus trên tế bào MARC-145. Khi chuyển vimentin tái tổ hợp vào 2 dòng tế bào BHK-21 và CRFK (Crandall Rees feline kidney), không nhạy cảm với virus PRRS, thì 2 dòng tế bào này trở nên nhạy cảm với PRRSV, điều đó chứng tỏ sự tấn công và gây nhiễm của virus liên quan tới vimentin, 1 loại intermediate-filament protein (Jeong-Ki Kim và cs, 2005). Khi gây nhiễm tế bào, hầu hết các chủng virus PRRS đều gây bệnh tích tế bào nhưng vẫn có một số chủng virus PRRS thì không (Christianson và Joo, 1994; Yoon và cs, 1992). Bệnh tích tế bào do virus PRRS gây ra là: tế bào co tròn, tập trung lại, sau đó dày lên, nhân co lại và cuối cùng là tách ra khỏi bề mặt nuôi cấy (dẫn liệu Hoàng Văn Năm, 2001). Benfield và cs (1992) cũng mô tả bệnh tích tế bào do virus PRRS gây ra như: các tế bào co tròn, trở nên thoái hoá (nhân kết đặc lại) và tách khỏi tế bào một lớp sau 2- 4 ngày nuôi cấy. Toàn bộ lớp tế bào bong ra sau 6 ngày. Các dòng PRRSV của Bắc Mỹ phát triển khá tốt trên MARC-145 trong khi các dòng PRRSV của Châu Âu phát triển nhanh hơn trên PAM. Nhiều phòng thí nghiệm ở Hàn Quốc và Bắc Mỹ chỉ sử dụng MARC-145 vì khó khăn khi phải nuôi cấy PAM (Han-Kook Chung và cs, 2002). Một nghiên cứu khác của Bloemraad (1994) cho thấy sau 40 giờ nuôi cấy, gần 40% tế bào PAM có bệnh tích tế bào. Tuy nhiên, kết quả này có thể thay đổi giữa các phòng thí nghiệm (Yoon, 2003). 1.3.3. Sức đề kháng của virus Virus PRRS tồn tại được trong thời gian dài hơn 4 tháng ở -700C đến -200C nhưng khoảng 90% khả năng gây nhiễm của virus bị mất trong vòng 1 tuần ở 40C. khả năng hồi phục của virus đã được báo cáo kéo dài đến 20 phút ở 560C, 24 giờ ở 370C và 6 ngày ở 210C. Virus bền vững ở pH từ 6,5 -7,5 nhưng chết nhanh khi pH 7,65 (Benfield và cs, 1999). Như vậy, virus PRRS không bền với nhiệt độ và pH. Ngoài ra, virus dễ bị diệt bởi chất sát trùng và tia cực tím 7  (dẫn liệu Trần Thanh Phong, 1996). Các chất tẩy uế có tác dụng làm giảm khả năng lây nhiễm của virus và các chất tan dầu mỡ như chloroform và eter đặc biệt hữu hiệu trong việc phá vỡ cấu trúc vỏ ngoài của virus và làm ngừng sự tái sản (Trần Đức Minh). 1.3.4. Triệu chứng lâm sàng: Lợn nái giai đoạn đẻ và nuôi con: Biếng ăn, lười uống nước, mất sữa và viêm vú, đẻ sớm khoảng 2-3 ngày, da biến màu, lờ đờ hoặc hôn mê, thai gỗ (10-15% thai chết trong 3-4 tuần cuối của thai kỳ), lợn con chết ngay sau khi sinh (30%), lợn con yếu, tai chuyển màu xanh. Tỷ lệ chết ở đàn con có thể tới 70% ở tuần thứ 3-4 sau khi xuất hiện triệu chứng. Rối loạn sinh sản có thể kéo dài 4-8 tháng trước khi trở lại bình thường. Lợn đực giống: Bỏ ăn, sốt, đờ đẫn hoặc hôn mê, giảm hưng phấn hoặc mất tính dục, lượng tinh dịch ít, chất lượng tinh kém và cho lợn con sinh ra nhỏ. Lợn con theo mẹ: Thể trạng gầy yếu, nhanh chóng rơi vào trạng thái tụt đường huyết do không bú được, mắt có dử màu nâu, trên da có vết phồng rộp, tiêu chảy nhiều, giảm số lợn con sống sót, tăng nguy cơ mắc các bệnh về hô hấp, chân choãi ra, đi run rẩy.. Lợn con cai sữa và lợn choai: Chán ăn, ho nhẹ, lông xác xơ... tuy nhiên, ở một số đàn có thể không có triệu chứng. Bệnh tích: Viêm phổi hoại tử và thâm nhiễm đặc trưng bởi những đám chắc, đặc trên các thuỳ phổi. Thuỳ bị bệnh có màu xám đỏ, có mủ và đặc chắc (nhục hoá). Trên mặt cắt ngang của thuỳ bệnh lồi ra, khô. Nhiều trường hợp viêm phế quản phổi hoá mủ ở mặt dưới thuỳ đỉnh. Điều trị: Hiện nay, vẫn chưa có thuốc đặc trị để điều trị bệnh này. Có thể sử dụng một số thuốc tăng cường sức đề kháng, điều trị triệu chứng và chủ yếu ngăn ngừa nhiễm bệnh kế phát. Phòng bệnh: Có thể sử dụng vaccine và các biện pháp vệ sinh chuồng trại. Vaccine bệnh heo tai xanh đang có bán tại Công ty thuốc thú y TW 29 Nguyễn Đình Chiểu Quận 1 TP. HCM. Đây là nơi nhập khẩu duy nhất Vaccine phù hợp với bệnh heo tai xanh ở VN. 1.4. Chẩn đoán PRRSV: 1.4.1 Chẩn đoán lâm sàng 8  Theo Benfiled (1999), khi trong đàn heo có dấu hiệu rối loạn hô hấp trên các hạng heo, sinh sản bất ổn và năng suất đàn giảm hơn bình thường thì có thể nghi ngờ bệnh do virus PRRS. Mặt khác, theo Taylor (1995) và dẫn liệu của Hoàng Văn Năm (2001) có cơ sở nghi ngờ bệnh khi: • Tỷ lệ chết lúc sinh >20% • Tỷ lệ sảy thai >8% • Tỷ lệ heo con chết trước khi cai sữa >26% • Tỷ lệ heo con chết trong tuần đầu tiên vượt quá 25%. Tuy nhiên, để xác định đúng căn bệnh cần thực hiện các phương pháp chẩn đoán phi lâm sàng khác (dẫn liệu của Võ Thị Đan Thanh, 2006). 1.4.2 Chẩn đoán phi lâm sàng: Dựa vào các triệu chứng lâm sàng và bệnh tích mô tả ở phần trên để chẩn đoán. Trong phòng thí nghiệm, có thể dùng phản ứng Immunoperoxidase một lớp (IPMA) để phát hiện kháng thể 1-2 tuần sau khi nhiễm; phản ứng kháng thể huỳnh quang gián tiếp (IFA) kiểm tra kháng thể IgM trong 5-28 ngày sau khi nhiễm và kiểm tra kháng thể IgG trong 7-14 ngày sau khi nhiễm; phản ứng ELISA phát hiện kháng thể trong vòng 3 tuần sau khi tiếp xúc, tuy nhiên chỉ xác định được tỷ lệ nhiễm.Một phương pháp khác là chẩn đoán bằng nuôi cấy tế bào động vật sau đó dùng RT- PCR để xác định( có thể sử dụng phương pháp nhuộm miễn dịch, hóa miễn dịch), mặc dù việc nuôi cấy phân lập virus trên môi trường tế bào khó, tuy nhiên xác định sự hiện diện của virus từ mẫu huyết thanh dương tính và các mẫu lâm sàng là rất cần thiết để làm cơ sở cho công tác phòng bệnh và các nghiên cứu sau này 1.4.2.1. Phương pháp phát hiện kháng thể 1.4.2.1.1. Phản ứng IPMA (Immuno peroxidase Monolayer Assay) Đây là phản ứng đầu tiên được sử dụng để phát hiện kháng thể kháng virus PRRS được gọi là kỹ thuật miễn dịch peroxidase một lớp. Kỹ thuật này có thể thực hiện trên các dòng tế bào PAM, CL2621, MARC-145. Tế bào sau khi nuôi cấy 24 giờ sẽ được gây nhiễm với PRRSV và được ủ ở 370C trong 24 giờ. Sau đó tế bào được gây nhiễm sẽ được cố định và tác dụng với huyết thanh mẫu, ủ khoảng 1 giờ ở 370C và được cho tác dụng tiếp tục với kháng kháng thể heo cộng hợp HRPO (horseradish peroxidase). Nếu mẫu huyết thanh có chứa kháng thể kháng virus thì 30- 50% tế bào sẽ có màu đỏ khi cho lớp tế bào tác dụng với dung dịch chromogen trong 30 phút. Không có sự thay đổi màu của tế bào khi kết quả là âm tính. IPMA được sử dụng nhiều ở châu âu. Trong chẩn đoán phát hiện thú nhiễm sớm, người ta thường sử dụng IPMA vì xét nghiệm này cho phép xác định thú nhiễm sau 7-15 ngày và có thể phát hiện kháng thể đến 3 tháng sau khi nhiễm PRRSV (Nguyễn Ngọc Hải, 2007). Nhược điểm của phương pháp này là không thể xác định trực tiếp hàm lượng kháng thể bảo vệ. 1.4.2.1.2. Phản ứng IFA (Indirect Immunhofloresence Assay) Giống như trong kỹ thuật IPMA, kỹ thuật IFA (kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang gián tiếp) cũng sử dụng nuôi cấy tế bào. Quá trình thực hiện IFA cũng giống với IPMA, chỉ khác là kháng kháng thể heo sử dụng không cộng hợp với HRPO mà cộng hợp với chất phát huỳnh quang FITC (fluorescein isothiocynate). Việc đọc kết quả cần phải có kính hiển vi huỳnh quang. sự hiện diện 9  của màu huỳnh quang trong mẫu xét nghiệm chứng tỏ mẫu có kháng thể kháng virus. Phản ứng có độ đặc hiệu cao 99,5% và cho phép phát hiện kháng thể kháng virus đến 3 tháng sau khi nhiễm (Nguyễn Ngọc Hải, 2007). Nhược điểm của IFA và IPMA là không thể làm tự động nên khó thực hiện với quy mô lớn. 1.4.2.1.3. Phản ứng SN (Serum Neutralizing) Đây là phản ứng trung hòa virus, phản ứng này có độ đặc hiệu cao nhất, được sử dụng để phát hiện và định hiệu giá kháng thể kháng virus. Nhược điểm của phản ứng này là đắc tiền, khó thực hiện và tốn thời gian vì kháng thể trung hoà xuất hiện chậm (1-2 tháng sau khi nhiễm). Tuy nhiên đây là phản ứng rất tốt để xác định miễn dịch bảo hộ (Nguyễn Ngọc Hải, 2007 và dẫn liệu của Võ Thị Đan Thanh, 2006). 1.4.2.1.4. Phản ứng ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) Xét nghiệm ELISA (xét nghiệm miễn dịch hấp phụ gắn kết enzyme) có độ nhạy và độ đặc hiệu cao và thực hiện đơn giản hơn so với IFA và IPMA, có thể phát hiện kháng thể trong vòng 3 tuần sau khi nhiễm bệnh. Tuy nhiên hạn chế lớn nhất của phương pháp này là dễ cho kết quả dương tính giả. Tỷ số S/P (sample/position)≥0,4 thì kết quả được ghi nhận là dương tính. Các phản ứng IFA, SN, ELISA được sử dụng nhiều trong các phòng thí nghiệm ở miền Nam nước Mỹ (Nguyễn Ngọc Hải, 2007). 1.4.2.2. Các phương pháp phát hiện kháng nguyên Phương pháp FA (florescent antibody staining-kháng thể huỳnh quang) và IHC (immunohistochemistry staining-hoá mô miễn dịch) có thể được sử dụng để phát hiện kháng nguyên virus trong mẫu mô. Phương pháp FA có thể thực hiện trực tiếp trên các mẫu đông lạnh. Phương pháp này cho kết quả nhanh và chi phí thấp, tuy nhiên lại có độ nhạy và độ đặc hiệu không cao. để đảm bảo kết quả chẩn đoán, mẫu cần được lấy và làm lạnh nhanh. Phương pháp IHC cũng được thực hiện trên mẫu mô cắt lát, tuy nhiên phương pháp này có thể thực hiện với các mẫu mô đã được cố định bằng formol. Điều này là khá quan trọng vì rất thuận lợi trong việc bảo quản mẫu bệnh phẩm. IHC có độ nhạy cao hơn so với FA nhưng mất nhiều thời gian và tốn chi phí hơn (Nguyễn Ngọc Hải, 2007). 1.4.2.3 Phát hiện gen của virus PRRS Kỹ thuật PCR được phát triển để phát hiện RNA của virus PRRS trong các mẫu bệnh phẩm. Kỹ thuật này không những có độ đặc hiệu và độ nhạy cao mà thời gian cần thiết thực hiện xét nghiệm cũng ngắn hơn so với phương pháp nuôi cấy tế bào vì thế nó được sử dụng khá rộng rãi trong chẩn đoán phát hiện virus. Nhiều dạng khác nhau của PCR được sử dụng, hầu hết chúng được sử dụng để phát hiện các vùng ORFs 7, ORFs 6 hay ORFs 1b của virus. Để gia tăng độ nhạy trong chẩn đoán PRRSV, nhất là để phân biệt 2 dòng virus thì Han-Kook Chung và cs (2002) đã sử dụng phương pháp multiplex reverse transcription-nested PCR (RT-nPCR) . Fun in wang (1994) đã sử dụng kỹ thuật RT-PCR trực tiếp để phát hiện sự tồn tại của virus PRRS trong xác heo thương phẩm và trong tinh dịch con đực. Tuy nhiên kết quả chẩn đoán chưa đủ làm cơ 10  sở để kết luận bệnh mà chỉ cho phép xác định tình trạng nhiễm của đàn và kỹ thuật này đòi hỏi kỹ thuật viên phải có trình độ kỹ thuật cao. Các quy trình thu nhận và trữ mẫu, quy trình chiết tách và tinh sạch RNA phải được thực hiện một cách nghiêm ngặt. Do đó kết quả của phản ứng PCR giữa các phòng thí nghiệm khác nhau có thể sẽ khác nhau. 1.4.2.4. Phân lập virus trên môi trường tế bào Trong phân lập virus, cũng như các phương pháp chẩn đoán khác, khâu đầu tiên và quan trọng nhất đó là cách lấy mẫu và bảo quản mẫu. Mẫu xét nghiệm có thể là huyết thanh, dịch tràn ổ bụng, dịch phế nang, dịch mẫu mô (hạch, phổi, lách). Trong số đó thì dịch phế nang và huyết thanh được đánh giá là mẫu tốt nhất cho việc phân lập virus khi dịch bùng phát. PRRSV tồn tại trong huyết thanh lâu hơn trong mô, nhưng đối với thú già thì lại có nhiều PRRSV trong mô hơn trong máu. Đối với các trường hợp sảy thai ở thời kỳ cuối hay sinh sớm thì nên lấy mẫu ở những heo con sinh ra yếu, trước khi cho bú hơn là thai khô, thai chết lưu. Việc phân lập virus đối với những thú nhiễm bệnh mãn tính thì hạch amiđan, dịch rữa khí quản là những mẫu có khả năng nuôi cấy tốt hơn so với mẫu huyết thanh và phổi. Một điểm quan trọng khác cần chú ý là nhiệt độ bảo quản mẫu trong quá trình vận chuyển và phân lập virus. Các mẫu bệnh phẩm cầ