Chuyên đề Cải tiến sản lượng cephalosporin C bằng ADN tái tổ hợp được hợp nhất trong acremonium chrysogenum

CHUYÊN ĐỀ:«CẢI TIẾN SẢN LƯỢNG CEPHALOSPORIN C BẰNG ADN TÁI TỔ HỢP ĐƯỢC HỢP NHẤT TRONG ACREMONIUM CHRYSOGENUM» Giáo viên hướng dẫn: Nguyễn Thị Minh Hằng Nhóm sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Kim Liên Nguyễn Thị Huyền Cấn Đỗ Tuần Hoàng Tiến Quyên Trần Đức Tài «CẢI TIẾN SẢN LƯỢNG CEPHALOSPORIN C BẰNG ADN TÁI TỔ HỢP ĐƯỢC HỢP NHẤT TRONG ACREMONIUM CHRYSOGENUM» Đặt vấn đề Tổng quan Nội dung và phương pháp Kết luận I. ĐẶT VẤN ĐỀ Kháng sinh là một nhóm thuốc được sử dụng phổ biến trong y học điều trị các bệnh viêm nhiễm do vi sinh vật gây ra. Cephalosporin C (CPC) thuộc nhóm β-lactam, là kháng sinh bán tổng hợp được sử dụng rộng rãi hiện nay. CPC được sản xuất bằng quy trình lên men truyền thống trên quy mô công nghiệp nhờ chủng nấm mốc Acremonium chrysogenum tự nhiên tuy vậy năng suất chưa cao. Áp dụng các kĩ thuật di truyền đã cải thiện quy trình tìm kiếm các chủng cho sản lượng cao. Từ đó cho phép tạo ra chủng nấm Acremonium chrysogenum mang ADN tái tổ hợp cho sản lượng kháng sinh cao trong quy trình sản xuất. Các gen được hợp nhất trong chủng Acremonium chrysogenum là các gen quan trọng trong con đường sinh tổng hợp CPC: cefEF, cefG ,vgb II. TỔNG QUAN Sơ lược về sự phát hiện kháng sinh Nấm mốc Acremonium chrysogenum Con đường sinh tổng hợp CPC SƠ LƯỢC VỀ SỰ PHÁT HIỆN KHÁNG SINH Hiện tượng kìm hãm khả năng gây bệnh của vi khuẩn Bacillus anthracis (Pasteur và Joubert, 1877) 1 chế phẩm tách từ nấm mốc dùng để điều trị các bệnh truyền nhiễm trên da do cầu khuẩn gây ra (Gratia và đồng nghiệp, 1925) SƠ LƯỢC VỀ SỰ PHÁT HIỆN KHÁNG SINH 1929, Fleming mô tả chi tiết chất kháng sinh trong báo cáo về Penicillin. Trong chiến tranh thế giới thứ II, kháng sinh được dùng để điều trị bệnh cho những người bị thương với số lượng lớn. Các nhà khoa học nhận thấy rằng không chỉ các vi sinh vật mà cả thực vật, động vật cũng có khả năng sinh kháng sinh. SƠ LƯỢC VỀ SỰ PHÁT HIỆN KHÁNG SINH Từ thực tế đó, Glasby(1976) đã đưa ra định nghĩa về chất kháng sinh: “ Một chất kháng sinh là một hợp chất được tổng hợp ta từ cơ thể sống và ức chế quá trình sống của vi sinh vật ngay ở nồng độ thấp”. Trong số đó thì kháng sinh nhóm β-lactam được sử dụng nhiều và phổ biến nhất. Các Cephalosporin C là kháng sinh bán tổng hợp thuộc nhóm β-lactam hiện đang được sử dụng rộng rãi vì phổ kháng khuẩn rộng và ít độc với con người. SƠ LƯỢC VỀ KHÁNG SINH Cephalosporin C gồm các thế hệ 1,2,3,4. Trong đó sử dụng nhiều là CPC thế hệ 1,2,3 còn thế hệ 4 được sử dụng hạn chế. Chủng vi nấm được sử dụng để sản xuất CPC trong công nghiệp là Acremonium chrysogenum (Cephalosporium acremonium). NẤM MỐC ACREMONIUM CHRYSOGENUM. Acremonium chrysogenum được dùng chủ yếu để sản xuất CPC trên quy mô công nghiệp. Cephalosporium là một chi thuộc nấm bất toàn (Deuteromycetes). Căn cứ vào đặc điểm của sinh sản hữu tính, thấy đó là các nấm thuộc chi Emericellopis trong chi nấm túi (Ascomycetes).Chi này còn có tên khác là Peyronellula hoặc Saturnomycetes. NẤM MỐC ACREMONIUM CHRYSOGENUM Đặc điểm chủ yếu của Acremonium chrysogenum: Khuẩn lạc có hình dạng khác nhau trên môi trường tổng hợp hoặc môi trường thạch – glucose – khoai tây. Màu sắc của khuẩn lạc Cephalosporium sp. có thể là màu đỏ nhạt, đỏ thẫm trắng, màu tro hoặc màu vàng. NẤM MỐC ACREMONIUM CHRYSOGENUM Khuẩn lạc khá chặt, sinh trưởng nhanh trên môi trường thạch – glucose – khoai tây, ban đầu màu trắng sau chuyển dần sang đỏ nhạt. Khuẩn ty khí sinh dạng nhung hay dạng lông nhung thường bện lại thành từng bó, có nếp nhăn dạng phóng xạ hoặc không. Mặt sau của khuẩn lạc có màu vàng nhạt. NẤM MỐC ACREMONIUM CHRYSOGENUM Các bào tử trần tụ lại thành khối chất nhày, khi gặp nước thì tan ra. Cuống bào tử trần ngắn, thẳng, không phân nhánh, không có vách ngăn, dạng gần tròn, hình trứng hoặc oval. MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY ĐƯỢC SỬ DỤNG: Thành phần của môi trường YPS (%): Cao nấm men: 4 Tinh bột: 15 KH2PO4: 1 MgSO4.7H2O: 0,5 Thạch: 15 pH = 7 (Theo USP 3,929,577 – 1975) Thành phần môi trường thạch – glucose – khoai tây (g/l): Khoai tây: 300 Glucose: 20 Thạch: 15 pH = 6 – 7 (Theo môi trường số 30,JCM) CON ĐƯỜNG SINH TỔNG HỢP CPC III. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP Tạo chủng Acremonium chrysogenum mang ADN tái tổ hợp. . Quy trình sản xuất CPC . Tối ưu hóa điều kiện lên men chủng A.chrysogenum mang gen tái tổ hợp TẠO CHỦNG ACREMONIUM CHRYSOGENUM MANG ADN TÁI TỔ HỢP Bước 1: Tách ADN tổng số từ khuẩn ty của nấm Acremonium chrysogenum bằng phương pháp tách chiết ADN Bước 2: Nhân dòng cefEF, cefG bằng kĩ thuật PCR Bước 3: Tạo chủng Acremonium chrysogenum tái tổ hợp Bước 4: Kiểm tra các chủng biến nạp bằng kĩ thuật lai Southern QUY TRÌNH SẢN XUẤT CPC 1. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG GIỐNG Thu nhận mẫu từ đất, nước, bùn. Sử dụng YPS và môi trường thạch – glucose – khoai tây được bổ sung Cephalosporin C (CPC) nhằm ức chế các chủng nấm và vi khuẩn khác không có khả năng kháng lại kháng sinh này. Môi trường có mọc khuẩn lạc nấm mốc dạng Cephalosporium được tách ra Kiểm tra hoạt tính bằng phương pháp cục thạch và nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng có hoạt tính 2.BẢO QUẢN VÀ HOẠT HÓA GIỐNG Giống được bảo quản trong glycerin vô trùng, và có thể dung ngay trong ống nghiệm bảo quản để nhân giống gốc trong sản xuất CPC bằng chủng này. Để bảo quản lâu dài sử dụng phương pháp đông khô là tốt nhất. Giống được hoạt hóa trên máy lắc 3-4 ngày (28oC, 200vòng) trước khi đưa vào môi trường lên men. 3. LÊN MEN SẢN XUẤT Tiến hành lên men theo 2 pha: Pha đầu: nuôi thu sinh khối trong 2 – 3 ngày, nhiệt độ: 20 – 300C, pH: 6,5 – 6,8 Pha sau: lên men thu sản phẩm, nhiệt độ: 22 – 250C, pH thường thấp hơn pha đầu do tạo ra ở các pha đầu là các acid, thời gian lên men từ 5 – 7 ngày, chất phá bọt thường được sử dụng: mỡ lợn, dầu thực vật… 4. TÁCH CHIẾT VÀ TINH CHẾ SẢN PHẨM TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN LÊN MEN CHỦNG A.CHRYSOGENUM MANG GEN TÁI TỔ HỢP Phải đảm bảo các yếu tố môi trường như: Nguồn Carbon: nguồn glucose và rỉ đường là nguồn cacbon tốt nhất cho quá trình nhân giống chủng A.chrysogenum. Lượng sinh khối hình thành sau 96h trong điều kiện nuôi cấy lắc đạt 8,35-8,50mg/ml. Nguồn Nitơ:casein thủy phân, các muối amoni sunphat và amoni clorua có tác dụng tốt tới quá trình lên men sinh tổng hợp CPC. Ngoài ra còn có bột đậu tương cũng là nguồn nitơ có giá trị cao, acid gluctamic: 19,46%, acid aspartic: 3,89%, cystein: 1,12%, gluxit:22-35,5% , 1 số vitamin và muối khoáng. MÔI TRƯỜNG NHÂN GIỐNG (NH4)2SO4: 8 g/l sucrose :35g/l glucose : 5g/l Methionin : 0,5 g/l CaCO3 :5 g/l Bean oli :10 g/l PH = 6,5. Ủ trong 3ngày ở 28oC, tốc độ lắc 230vòng/phút MÔI TRƯỜNG LÊN MEN + Cao ngô :100g/l + Tinh bột :30 g/l + Dextrin : 60 g/l + Glucose : 5 g/l + Methionin : 6 g/l + Urine : 3 g/l + KH2PO4 : 9 g/l + MgSO4 : 3 g/l + (NH4)2SO4 : 13 g/l + CaCO3 : 10 g/l + Vi lượng : 10g/l + Bean oil : 20 g/l Nuôi trong 7 ngày, ở 25oC, tốc độ lắc 230vòng/phút Ngoài ra còn cần chú ý đến các điều kiện khác như: Thời gian nhân giống thích hợp cho lên men CPC là 96h Độ thông khí: do A.chrysogenum là sinh vật hiếu khí bắt buộc nên lượng môi trường trong bình lên men thích hợp nhất là 10% thể tích bình lên men. IV.KẾT LUẬN Bằng việc các gen cefG, cefEF, vgb được hợp nhất trong nhiễm sắc thể của A.chrysogenum mà sản lượng của sinh tổng hợp của CPC đã tăng lên 86-116,3%. Việc tìm thấy điều kiện lên men tối ưu cho chủng nấm Acremonium chrysogenum mang ADN tái tổ hợp cũng có vai trò rất lớn trong quy trình sản xuất CPC bằng phương pháp lên men chìm. KẾT LUẬN CPC được điều chế bằng phương pháp lên men sinh tổng hợp bằng chủng Acremonium chrysogenum tuy nhiên hoạt tính kháng khuẩn không cao bằng các CPC bán tổng hợp. Để sản xuất các CPC bán tổng hợp có giá trị chữa bệnh cao phải chuyển hóa kháng sinh này thành “nhân” 7-ACA từ đó bán tổng hợp thành kháng sinh mới. Quá trình sinh tổng hợp CPC bán tổng hợp có thể bằng con đường enzym và con đường hóa học. Quá trình được mô tả qua sơ đồ sau: