Luận văn Nghiên cứu sử dụng vi khuẩn lactic để sản xuất chế phẩm probiotic phòng và trị bệnh đường ruột cho heo

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH o0o TRẦN THỊ MỸ TRANG NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI KHUẨN LACTIC ĐỂ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM PROBIOTIC PHÒNG VÀ TRỊ BỆNH ĐƯỜNG RUỘT CHO HEO LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh 2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ..o0o.. TRẦN THỊ MỸ TRANG NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI KHUẨN LACTIC ĐỂ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM PROBIOTIC PHÒNG VÀ TRỊ BỆNH ĐƯỜNG RUỘT CHO HEO Chuyên ngành: Vi sinh vật Mã số: LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học TS. Trần Thanh Thủy Thành phố Hồ Chí Minh 2006 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng chân thành và biết ơn sâu sắc đến: Phòng Khoa học và Công nghệ sau đại học Trường Đại học Sư Phạm thành phố Hồ Chí Minh, Sở Giáo dục và Đào tạo tỉnh Sóc Trăng, Ban giám hiệu Trường cao đẳng Sư phạm Sóc Trăng đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt khóa học. TS. Trần Thanh Thủy, người đã tận tình hướng dẫn, giúp đễ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành tốt luận văn. Quý thầy cô phụ trách phòng thí nghiệm Bộ môn Vi sinh, Sinh lý, Sinh hóa Trường Đại học Sư Phạm thành phố Hồ Chí Minh và Viện Sinh học nhiệt đới Tp. Hồ Chí Minh đã hỗ trợ, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện các thí nghiệm của đề tài. Gia đình anh Bùi Thủy Lâm và chị Ngũ Ái Nữ, 443/1 Ấp Đông Hải, xã Đại Hải, huyện Kế Sách, tỉnh Sóc Trăng đã hỗ trợ và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thí nghiệm chế phẩm. Tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành đến những người thân của tôi, gia đình và bạn bè luôn động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Trần Thị Mỹ Trang MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................... 3 MỤC LỤC ............................................................................................................. 4 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ................................................................. 7 DANH MỤC CÁC BẢNG ................................................................................... 8 DANH MỤC CÁC HÌNH .................................................................................. 10 DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ .............................................................................. 11 MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 12 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 13 1.1. Giới thiệu về probiotic .......................................................................................... 13 1.1.1. Lược sử nghiên cứu probiotic ......................................................................... 13 1.1.2. Thành phần và đặc điểm vi sinh vật được sử dụng trong probiotic ................ 13 1.1.3. Cơ chê tác động của probiotic ......................................................................... 14 1.1.4. Vai trò của probiotic ........................................................................................ 18 1.2. Vi khuẩn lactic ...................................................................................................... 22 1.2.1. Đặc điểm hình thái .......................................................................................... 22 1.2.2. Phân loại vi khuẩn lactic ................................................................................. 23 1.2.3. Quá trình lên men lactic .................................................................................. 24 1.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn lactic ...... 26 1.2.5. ứng dụng của vi khuẩn lactic trong sản xuất các chế phẩm sinh học phục vụ đời sống ..................................................................................................................... 29 1.3. Giới thiệu về heo con ............................................................................................ 30 1.3.1. Vị trí phân loại của heo. .................................................................................. 30 1.3.2. Đặc điểm sinh lý tiêu hóa ở heo con ............................................................... 30 1.3.3. Các bệnh đường ruột ồ heo con ....................................................................... 31 1.3.4. Các biện pháp phòng và điều trị ...................................................................... 32 1.4. Sơ lược tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotic trên gia súc, gia cầm ...... 34 1.4.1. Những nghiên cứu trong nước ......................................................................... 34 1.4.2. Những nghiên cứu ở nước ngoài ..................................................................... 35 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 36 2.1. Vật liệu ................................................................................................................... 36 2.1.1. Nguyên liệu ..................................................................................................... 36 2.1.2. Hóa chất ........................................................................................................... 36 2.1.3. Thiết bị và dụng cụ .......................................................................................... 36 2.1.4. Môi trường ....................................................................................................... 37 2.2. Các phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 41 2.2.1. Khả năng sinh axit lactỉc của vi khuẩn lactic .................................................. 41 2.2.2. Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sình lý, sinh hóa ..................................... 42 2.2.3. Phương pháp bảo quản giống vi khuẩn lactic ................................................. 46 2.2.4. Xác định gián tiếp mật độ tế bào bằng phương pháp đêm số khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch ................................................................................................ 47 2.2.5. Khảo sát sự sinh trưởng và và các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của vỉ khuẩn lactic bằng phương pháp đo mật độ quang .......................................... 47 2.2.6. Phương pháp tổ hợp giống vi khuẩn lactic ...................................................... 50 2.2.7. Tạo chế phẩm probiotic ................................................................................... 50 2.2.8. Thương pháp thử nghiệm chế phẩm trên heo con sau cai sữa ........................ 51 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 54 3.1. Tuyển chọn các chủng vỉ khuẩn lactic cố các đặc tính phù hợp vời yêu cầu tạo chế phẩm probiotic ...................................................................................................... 54 3.2. Khảo sát hoạt tính đề kháng vời các chất kháng sình của các chủng B,N4,L2 ........................................................................................................................................ 56 3.3. Các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của các chủng vỉ khuẩn lactic được tuyển chọn ..................................................................................................................... 57 3.3.1. Các đặc điểm hình thái của chủng B, N4, L2 .................................................. 57 3.3.2. Các đặc điểm sinh ly, sinh hóa và phân loại chủng B, N4, L2 ....................... 58 3.4. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sự tạo thành sinh khối tế bào của 3 chủng vi khuẩn lactic ................................................................................................... 62 3.4.1. Ảnh hưởng cửa môi trường nuôi cấy đến sự tạo thành sinh khôi của các chủng vi khuẩn lactic............................................................................................................ 62 3.4.2. Ảnh hưởng của các điều kiện môi trường đến sự tạo thành sinh khối của các chủng vi khuẩn lactic ................................................................................................. 65 3.5. Động thái quá trình tạo sinh khối tế bào của các chủng vi khuẩn lactic trong điều kiện tối ưu ............................................................................................................. 74 3.6. Khả năng sống sót của các chủng vi khuẩn lactic sau khi đông khô ............... 76 3.7. Xác định tỷ lệ tổ hợp giống vi khuẩn lactic ........................................................ 77 3.8. Tạo chế phẩm probiotic ........................................................................................ 78 3.9. Kiểm tra khả năng sống sót của các chủng vi khuẩn lactic trong chế phẩm PSPoi ............................................................................................................................. 78 3.10. Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm PSP01 ............................................... 79 3.11. Bước đầu thử nghiệm chế phẩm PSP01 trên heo con sau cai sữa .................. 80 3.11.1. Tỷ lệ tiêu chảy ở heo con sau cai sữa ............................................................ 80 3.11.2. Tăng trọng ở heo con sau cai sữa .................................................................. 82 3.11.3. Hệ số tiêu tốn thức ăn .................................................................................... 83 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................ 85 Kết luận ......................................................................................................................... 85 Đề nghị .......................................................................................................................... 86 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 87 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ase Đuôi enzym B Lactobacillus agilis CFU Colony forming unit (mật độ tế bào) ĐC Đối chứng ETEC Enterotoxigenic E. coli G- Gram âm G+ Gram dương L2 Lactobacilus acidophilus MT Môi trường N4 Lactobacillus salivarius OD Optical density (mật độ quang) ose Đuôi cơ chất VK Vi khuẩn vsv Vi sinh vật DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Sản phẩm probiotic ở một số nước Bảng 1.2. Một số bacteriocin do VK lactic sinh ra Bảng 1.3. Ảnh hưởng của probiotic và axit lactic trên heo con và heo trưởng thành Bảng 1.4. Ảnh hưởng của probiotic lên vật nuôi Bảng 1.5. Nhu cầu axit amin của một số loài VK lactic Bảng 1.6. Nhu cầu vitamin cần cho sự phát triển của một số loài VK lactic Bảng 1.7. Thí nghiệm ở heo con Bảng 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm Bảng 3.1. Khả năng sinh axit lactic của các chủng VK lactic Bảng 3.2. Hoạt tính đối kháng của VK lactic đối với VK kiểm định Bảng 3.3. Hoạt tính đề kháng với các chất kháng sinh của chủng B, N4, L2 Bảng 3.4. Khả năng sinh trưởng và phát triển của chủng B, N4, L2 theo nhiệt độ Bảng 3.5. Khả năng sinh trưởng và phát triển của chủng B, N4, L2 ở những pH khác nhau Bảng 3.6. Khả năng sinh trưởng và phát triển của chủng B, N4, L2 ở những nồng độ muối khác nhau Bảng 3.7. Khả năng lên men các loại đường của các chủng VK lactic Bảng 3.8. Tổng hợp các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoa của chủng B, N4, L2 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của môi trường đến sự tạo thành sinh khối của chủng B, N4, L2 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự tạo thành sinh khối của chủng B, N4, L2 Bảng 3.11. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến sự tạo thành sinh khối của chủng B, N4, L2 Bảng 3.12. Ảnh hưởng của các nguồn nitơ đến sự tạo thành sinh khối của chủng B, N4, L2 Bảng 3.13. Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men đến sự tạo thành sinh khối của chủng B, N4, L2 Bảng 3.14. Ảnh hưởng của các nguồn cacbon đến sự tạo thành sinh khối của chủng B, N4, L2 Bảng 3.15. Ảnh hưởng của nồng độ saccharose đến sự tạo thành sinh khối của các chủng B, N4, L2 Bảng 3.16. Động thái quá trình tạo sinh khối, sinh axit lactic và độ pH của 3 chủng VK lactic Bảng 3.17. Tổng hợp các điều kiện để thu sinh khối tế bào của 3 chủng VK lactic Bảng 3.18. Sự biến động số lượng tế bào của 3 chủng VK lactic theo thời gian bảo quản Bảng 3.19. Hoạt tính đối kháng của các tỷ lệ phối trộn với các chủng VK kiểm định Bảng 3.20. Sự biến động số lượng tế bào của 3 chủng VK trong chế phẩm PSPoi theo thời gian bảo quản Bảng 3.21. Tỷ lệ tiêu chảy trên heo con sau cai sữa (%) Bảng 3.22. Tăng trọng bình quân của heo con từ 28 đến 56 ngày tuổi Bảng 3.23. Hệ số tiêu tốn thức ăn trong thời gian thí nghiệm DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Tác động của probiotic trong điều trị các chứng rối loạn đường tiêu hoa (Salminen, 1998) Hình 1.2. L. acidophilus Hình 1.3. Sơ đồ chuyển hóa glucose thành axit lactic bằng con đường lên men lactic đồng hình (a) và lên men lactic dị hình (b) Hình 2.1. Phương pháp khoan lỗ thạch Hình 3.1. Khả năng sinh axit lactic của chủng L2 và chủng B Hình 3.2. Hoạt tính đối kháng với E. coli và s. typhỉmurỉum của chủng B, N4 và L2 Hình 3.3. Hoạt tính kháng neomicin, kanamicin, gentamicin của B, N4, L2 Hình 3.4. (a) Hình thái khuẩn lạc của chủng B, N4 và L2 (b) Hình thái tế bào của chủng B, N4 và L2 được chụp trên kính hiển vi điện tử quét X15.000- 20.000 Hình 3.5. Các chủng B, N4 và L2 sau đông khô Hình 3.6. Chế phẩm PSP()1 trước và sau khi đóng gói DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ Đồ thị 3.1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự tạo thành sinh khối chủng B Đồ thị 3.2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự tạo thành sinh khối chủng N4 Đồ thị 3.3. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự tạo thành sinh khối chủng L2 Đồ thị 3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự tạo thành sinh khối của chủng N4 Đồ thị 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự tạo thành sinh khối của chủng L2 Đồ thị 3.6. Ảnh hưởng của pM ban đầu đến sự tạo thành sinh khối của chủng L2 Đồ thị 3.7. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sự tạo thành sinh khối của chủng B Đồ thị 3.8. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sự tạo thành sinh khối của chủng N4 Đô thị 3.9. Anh hưởng của nguôn nitơ đèn sự tạo thành sinh khôi của chủng L2 Đồ thị 3.10. Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men đến sự tạo thành sinh khối của chủng L2 Đồ thị 3.11. Ảnh hưởng của nguôn cacbon đến sự tạo thành sinh khôi của chủng L2 Đồ thị 3.12. Ảnh hưởng của nồng độ saccharose đến sự tạo thành sinh khối của chủng L2 Đồ thị 3.13. Động thái quá trình tạo sinh khối trong điều kiện tối ưu của chủng B Đồ thị 3.14. Động thái quá trình tạo sinh khối trong điều kiện tối ưu của chủng N4 Đồ thị 3.15. Động thái quá trình tạo sinh khối trong điều kiện tối ưu của chủng L2 Đồ thị 3.16. Tỷ lệ tiêu chảy giữa các lô thí nghiệm Đồ thị 3.17. Kết quả tăng trọng giữa các lô thí nghiệm Đồ thị 3.18. Hệ số tiêu tốn thức ăn giữa các lô thí nghiệm MỞ ĐẦU VK lactic được biết đến từ lâu với vai trò quan trọng đối với sức khoe con người cũng như các vật nuôi. Chúng có tác dụng cạnh tranh và đối kháng với các VSV gây bệnh, giúp cân bằng hệ VSV tự nhiên trong đường ruột, tiết các enzym tiêu hoa giúp tăng cường chuyển hoa thức ăn,... Ngoài ra, chúng còn làm giảm lượng cholesteron trong máu, chữa các bệnh rối loạn đường ruột, bệnh viêm dạ dày cấp tính và chống lại hiện tượng nhờn thuốc sau thời gian điều trị kháng sinh dài ngày, đồng thời tạo ra các thức ăn bổ sung khoáng, vitamin cho người bệnh, cho những người ăn kiêng, ... [11]. Xuất phát từ cơ sở trên, nhiều nhà nghiên cứu đã tạo ra nhiều chế phẩm sinh học khác nhau từ các VK lactic, chủ yếu là từ nhóm Lactobacillus, để bổ sung các vsv có lợi, nhằm tạo sự cân bằng cho hệ vsv đường ruột, mang lại sức khoe lâu bền cho vật nuôi. Hướng nghiên cứu này được gọi là vi trùng liệu pháp (bacteriotherapy) và các chế phẩm được sử dụng theo hướng chữa trị này được gọi là các chế phẩm probiotic. Hiện nay, bệnh đường ruột của heo con ở giai đoạn sau cai sữa đã ảnh hưởng đến năng suất nuôi và gây thiệt hại không nhỏ cho người nuôi. Việc sử dụng thuốc kháng sinh dài ngày để trị bệnh đường ruột cho heo sẽ tạo khả năng đề kháng với các chất kháng sinh của vsv gây bệnh. Vì vậy, việc phòng và trị bệnh bằng chế phẩm probiotic nhằm tăng cường khả năng tự đề kháng bệnh cho vật nuôi là cách làm có hiệu quả lâu dài và an toàn sinh học. Đây cũng chính là vấn đề mà các nhà nghiên cứu, người chăn nuôi đang hết sức quan tâm. Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi chọn đề tài nghiên cứu là : "Nghiên cứu sử dụng vi khuẩn lactỉc để sản xuất chế phẩm probiotic phòng và trị bệnh đường ruột cho heo”. Với mục tiêu : Nghiên cứu và sử dụng một số chủng VK lactic nhằm bổ sung vào bộ giống tạo chế phẩm phòng và trị bệnh đường ruột cho heo. Nội dung của đề tài bao gồm : - Tuyển chọn các chủng VK lactic có khả năng sinh axit lactic cao, có khả năng cạnh tranh và đối kháng với các vsv kiểm định, có khả năng đề kháng với các kháng sinh trị bệnh đường ruột của heo. - Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoa và phân loại các chủng VK lactic được tuyển chọn. - Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo sinh khối tế bào của các chủng VK lactic được tuyển chọn. - Xác định tỷ lệ tổ hợp giống VK lactic trong chế phẩm. - Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm probiotic trong phòng thí nghiệm. - Kiểm tra chất lượng chế phẩm. - Bước đầu thử nghiệm chế phẩm trên heo con sau cai sữa. Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về probiotic 1.1.1. Lược sử nghiên cứu probiotic Sự hiểu biết về probiotic của con người bắt nguồn từ sự hiểu biết về hệ VK đường ruột kháng bệnh ở người và vật nuôi. Khái niệm probiotic đầu tiên được mô tả như là hệ vsv trong thức ăn bổ sung cho người và vật nuôi. Năm 1925, Beach là người đầu tiên có những nghiên cứu thực nghiệm về thức ăn có chứa "Lactobacilius acidophilus" [46]. Năm 1965, thuật ngữ probiotic được đưa ra đầu tiên bởi Lilly và Stillwell, nhằm mô tả những vsv có khả năng kích thích sinh trưởng của một sô vật nuôi. Năm 1968, King đã nghiên cứu thành công trong việc kích thích sự tăng trưởng của heo bằng thức ăn có bổ sung Lactobacillus acidophilus [42], [46]. Năm 1989, Fuller (Anh) định nghĩa probiotic như là một thức ăn bổ sung vsv sống, có tác động có lợi đến vật chủ nhờ khả năng duy trì sự cân bằng hệ vsv đường ruột. Theo Lee (Singapore), Nomoto (Nhật), Salminen (Phần lan), Gorbach (Anh) (1999) thì “Probiotic là chế phẩm sinh học hay là thức ăn bổ sung có chứa tế bào VK sống hoặc những phần tử của VK mà nó ảnh hưởng có lợi cho sức khoe của vật chữ” [41], [42], [46]. 1.1.2. Thành phần và đặc điểm vi sinh vật được sử dụng trong probiotic Theo Lee, Nomoto, Salminen, Gorbach (1999), những VK lactic có lợi thường được sử dụng trong các chế phẩm probiotic như L. acidophilus, Lactobacillus deibrueckii subs, Lactobacillus casei, L. plantarum, L. bulgaricus, Bifidobacterium breve, Enterococcus faecium ... Theo Power và Moore (1994), trong probiotic ngoài các VK lactic có lợi còn có nấm men và nấm mốc như Saccharomyces cerevislae (nấm men), Aspergillus niger và Aspergillus oryzae (nấm mốc) Bảng 1.1 dưới đây giới thiệu một vài sản phẩm probiotic ở một số nước đã sử dụng VK lactic là nguồn vsv chính trong chế phẩm. Các VK lactic trong chế phẩm probiotic có khả năng bám chặt vào màng nhầy của ruột, ức chế sự bám của vsv gây bệnh. Chúng sản xuất các axit lactic làm giảm pH đường ruột, tạo môi trường không thuận lợi cho vsv có hại phát triển. Ngoài ra, chúng còn sản xuất chất kháng sinh, sinh H202, sản xuất các enzym tiêu hoa (amylase, cellulase, lipase, protease), các vitamin (Bi, B2, B6, B12), khử độc tố trong đường ruột [1], [42], [46]. Nấm men trong chế phẩm probiotic tạo ra sinh khối chứa axit amin, các vitamin nhóm B, hấp thu độc tố và bài thải ra ngoài. Chúng chuyển hoa glucose thành axi