Luận văn Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn cố định Nitơ tự do Azotobacter sp. trên một số loại đất ở Đắk Lắk

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN LÊ QUANG DŨNG PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN CỐ ĐỊNH NITƠ TỰ DO Azotobacter sp. TRÊN MỘT SỐ LOẠI ĐẤT Ở ĐĂK LĂK LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC BUÔN MA THUỘT, NĂM 2011 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực, được các đồng tác giả cho phép sử dụng và chưa được công bố trong bất kỳ một công trình nào khác. Họ tên tác giả Lê Quang Dũng LỜI CẢM ƠN Trong quá trình học tập nghiên cứu và để hoàn thành bản luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và kính trọng đến: PGS.TS. Nguyễn Anh Dũng, người trực tiếp hướng dẫn khoa học, đã tận tình chỉ dẫn tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp. PGS. TS. Nguyễn Hữu Hiệp, TS. Võ Thị Phương Khanh, Thầy cô giáo trong bộ môn sinh học khoa KHTN&CN, cùng tập thể các thầy cô giáo của trường đại học Tây Nguyên đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập nghiên cứu và đóng góp những ý kiến quý báu cho tôi hoàn thành luận văn này. Những anh chị lớp cao học Sinh Học Thực Nghiệm khóa 3, đã cùng tôi san sẽ những buồn vui, cùng nhau học tập và trao đổi kiến thức trong quá trình làm đề tài. Các em sinh viên CN Sinh K07 và các anh chị làm việc trong bộ môn sinh học thực vật, bộ môn khoa học về đất, đã sẵn sàng giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn những nhà khoa học trong ngành, các đồng nghiệp, bạn bè và người thân đã động viên giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu làm luận văn tốt nghiệp. Đăk Lăk, tháng 10 năm 2011. Tác giả Lê Quang Dũng DANH MỤC CÁC BẢNG 2.1 Nồng độ IAA thành lập đồ thị đường chuẩn 29 3.1 Ký hiệu, địa điểm phân lập các chủng vi khuẩn trên môi trường Ashby 34 3.2 Mô tả Hình thái khuẩn lạc của 24 chủng vi khuẩn phân lập được 36 3.3 Khả năng cố định nitơ của các chủng vi khuẩn Azotobacter sp. 40 3.4 Khả năng sinh IAA của các chủng vi khuẩn Azotobacter sp. 42 3.5 Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn Azotobacter sp. đến số lá cây cải ngọt 44 3.6 Ảnh hưởng các chủng vi khuẩn Azotobacter sp. đến chiều cao cây cải ngọt 45 3.7. Ảnh hưởng của các chủng VK Azotobacter sp. đến khối lượng rễ cây cải 47 3.8. Ảnh hưởng của các chủng VK Azotobacter sp. đến năng suất cây cải ngọt 48 3.9. Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn Azotobacter sp. đến số lá cây cải ngọt 50 3.10. Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn Azotobacter sp. đến chiều cao cây cải ngọt 52 3. 11. Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn Azotobacter sp. đến khối lượng rễ cây cải ngọt 53 3.12. Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn lên diện tích lá cây cải ngọt 55 3.13. Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn Azotobacter sp. đến năng suất cây cải ngọt 56 3.14. Hàm lượng nitơ tổng số (mg/l) của 4 chủng vi khuẩn Azotobacter sp. tuyển chọn nuôi cấy từ các nguồn carbon khác nhau. 58 3.15. Hàm lượng nitơ tổng số (mg/l) của 4 chủng vi khuẩn Azotobacter sp. tuyển chọn nuôi cấy ở các nồng độ glucose khác nhau 61 3.16. Hàm lượng nitơ tổng số (mg/l) của bốn chủng vi khuẩn Azotobacter sp. tuyển chọn nuôi cấy trên các khoản nhiệt độ khác nhau 63 3.17. Hàm lượng nitơ tổng số (mg/l) của 4 chủng vi khuẩn Azotobacter sp. tuyển chọn được nuôi cấy ở các pH khác nhau 65 3.18. Hàm lượng nitơ tổng số (mg/l) của 4 chủng vi khuẩn Azotobacter sp. tuyển chọn nuôi cấy ở các thời gian khác nhau 67 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Giữa đất, vi sinh vật và cây trồng có mối quan hệ tác động qua lại lẫn nhau. Quá trình hình thành đất và độ phì của đất chịu ảnh hưởng của các yếu tố vật lí, hóa học và vi sinh vật. Vi sinh vật tổng hợp và giải phóng vào đất những chất hữu cơ cần thiết tạo độ phì cho đất, ngược lại đất là môi trường sống cần thiết cho vi sinh vật, đất và vi sinh vật cùng tác động rất lớn đến cây trồng, đặc biệt cung cấp nguồn dinh dưỡng, một trong các nguồn dinh dưỡng quan trọng cho cây trồng là nguồn nitơ [8]. Người ta nhận thấy muốn thu hoạch 12 tạ hạt trên mỗi hecta, cây trồng lấy đi khỏi đất khoảng 30 kg nitơ [3]. Theo thống kê hàng năm các sản phẩm nông nghiệp trên thế giới lấy đi khỏi đất khoảng 100 – 110 triệu tấn nitơ (G. Colar và Greenland) [3]. Trong khi đó lượng phân nitơ hóa học hiện nay chỉ bù đắp được một phần lượng nitơ mà cây lấy đi khỏi đất. Lạm dụng quá mức việc sử dụng phân hóa học làm đất xấu đi, mất cân đối các chất dinh dưỡng và làm giảm hệ vi sinh vật có ích, hơn nữa việc sản xuất phân nitơ hóa học còn gặp nhiều khó khăn, giá thành khá cao. Vấn đề đặt ra là làm thế nào để bổ sung lượng dinh dưỡng nitơ cho đất một cách có hiệu quả nhất, vừa tiết kiệm được chi phí sản xuất, bảo vệ được môi trường. Một trong những giải pháp đang được áp dụng để cải tạo đất hiện nay là sử dụng phân bón vi sinh vật. Nhóm vi sinh vật trong phân có tác dụng cải thiện độ phì, cân bằng dinh dưỡng trong đất, cải thiện các tính chất lý, hóa của đất, và đặc biệt hạn chế ô nhiễm môi trường, cũng như ô nhiễm môi trường nước do quá trình rửa trôi [1]. Trong tự nhiên, ngoài nguồn nitơ được tạo ra cho đất từ quá trình amon hóa, quá trình nitrat hóa, nguồn nitơ còn được tạo ra từ quá trình cố định nitơ phân tử được thực hiện bởi các nhóm vi sinh vật trong đất, trong đó có sự đóng góp của nhóm vi khuẩn cố định nitơ tự do Azotobacter sp. Các vi sinh vật thuộc nhóm này có khả năng chuyển hóa nitơ phân tử thành các hợp chất chứa nitơ mà cây trồng có khả năng hấp thụ được [3]. Azotobacter sp. là một loại vi khuẩn hiếu khí, sống tự do trong đất, chúng có khả năng cố định đạm cao và không phụ thuộc vào cây chủ. Ngoài đặc điểm trên thì một số chủng thuộc chi này còn có khả năng sinh tổng hợp nên IAA (chất kích thích sinh trưởng ở thực vật). Chính nhờ đặc điểm quan trọng đó vi khuẩn Azotobacter sp. được ứng dụng rộng rãi trong các chế phẩm phân bón vi sinh vật làm tăng năng suất cây trồng. Ở Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu về vi sinh vật cố định nitơ tự do trên một số loại đất để làm phân vi sinh, nhưng hiện nay chưa có một nghiên cứu nào về thành phần loài thuộc chi Azotobacter sp. trên một số loại đất ở Đăk Lăk. Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn cố định nitơ tự do Azotobacter sp. trên một số loại đất ở Đăk Lăk”. 2. Mục tiêu của đề tài - Tuyển chọn được một số chủng Azotobacter sp. cố định đạm cao trên một số loại đất ở Đăk Lăk. - Đánh giá hiệu quả của một số chủng vi khuẩn Azotobacter sp. đối với sự sinh trưởng của cây cải ngọt (Brassica juncea) 3. Ý nghĩa của đề tài Ý nghĩa khoa học Đề tài góp phần phân lập, tuyển chọn một số chủng vi khuẩn Azotobacter sp. bản địa có khả năng cố định đạm cao trên một số loại đất ở Đăk Lăk, góp phần vào công công tác bảo tồn đa dạng vi sinh vật ở Đăk Lăk và Tây Nguyên. Ý nghĩa thực tiễn Đề tài là cơ sở cho việc lựa chọn các chủng Azotobacter sp. trên một số loại đất ở Đăk Lăk có hoạt tính cố định nitơ cao để sản xuất phân vi sinh có hiệu quả, nâng cao độ phì nhiêu của đất, hạn chế bón phân hóa học, tăng năng suất cây trồng và góp phần phát triển một nền nông nghiệp sinh thái bền vững. Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Nguồn nitơ trong tự nhiên Trong nước, nitơ chủ yếu ở dạng hợp chất của NH4 +, NO2 -, NO3 -. Trong đất có 2 dạng nitơ tồn tại đó là nitơ vô cơ trong các muối khoáng và nitơ hữu cơ trong xác, chất bài tiết từ sinh vật. Các hợp chất chứa nitơ trong xác, chất bài tiết của động vật và thực vật bị một số loại nấm và vi khuẩn phân giải. Trong đất amon hầu như chuyển hóa toàn bộ thành hợp chất nitrat. Phần lớn hợp chất nitrat được thực vật hấp thụ, phần còn lại bị mất đi do mưa rửa trôi và tác dụng của phản nitrat hóa. Hợp chất đạm mà thực vật hút từ đất một phần như gốc rễ được trả lại đất, phần còn lại được động vật và thực vật dị dưỡng tiêu thụ, lại biến thành các chất bài tiết trả lại đất. Những chất hữu cơ này dưới tác dụng của nhiều loại vi sinh vật, nấm bị khử thành đạm ở dạng hữu hiệu. Nitơ trong không khí tồn tại chủ yếu ở dạng nitơ phân tử (N2) chiếm khoảng 80%, ở dạng nguyên tử kép (N2) được khóa chặt với nhau thông qua liên kết cộng hóa trị bền vững (N≡N). Mặc dù rất cần nguyên tố này, nhưng cây chỉ có thể hấp thụ được nitơ ở dạng NO3 - và NH4 + [3]. Để sử dụng được nguồn nitơ lớn từ không khí có 2 con đường chính là hóa học và sinh học. Hóa học: Kể từ năm 1920, phương pháp công nghiệp Haber - Bosch đã giúp con người phá vỡ liên kết ba này. Biện pháp này đòi hỏi phải thực hiện ở nhiệt độ rất cao (450 – 500oC), áp suất là 125 atm và Fe3+ là chất xúc tác. Các hợp chất nitơ được tổng hợp hóa học trên cung cấp cho cây trồng một nguồn nitơ lớn và ổn định. Tuy nhiên, bên cạnh việc sử dụng phân đạm tổng hợp hóa học cho nông nghiệp có thể làm tăng năng suất cây trồng thì cũng đem lại những tác hại cũng không nhỏ, vì trung bình chỉ có 40 – 50 % lượng đạm bón được cây hấp thu, phần còn lại gây ô nhiễm môi trường đất, nước, không khí từ đó gây hại thậm chí là tiêu diệt các sinh vật có lợi. Các hợp chất chứa nitơ của phân bón hóa học gây hại rất lớn đối với cá, động vật thân mềm và kể cả con người. Sinh học: Nhờ các vi sinh vật có thể tiết ra enzyme nitrogenase để thực hiện quá trình sinh học đặc biệt - quá trình cố định nitơ. Nhóm vi sinh vật có khả năng thực hiện quá trình này được gọi là các vi sinh vật cố định nitơ. Việc sử dụng phân bón vi sinh làm đất không bị ô nhiễm, khả năng giữ ẩm tốt hơn, tăng cường khả năng cải tạo đất do các hệ sinh vật có ích hoạt động mạnh làm cho đất tơi xốp hơn, cây dễ hút chất dinh dưỡng hơn. Ngoài ra, còn có các con đường tạo nitơ khác như do sấm chớp hay cháy [12]. 1.2. Vai trò của nitơ đối với thực vật Nitơ là thành phần quan trọng cấu tạo nên các phân tử hữu cơ như protein, diệp lục, ATP Hàm lượng nitơ trong thành phần các chất khô của thực vật dao động từ 1 – 3%. Tuy hàm lượng trong cây thấp nhưng nitơ có vai trò sinh lý đặc biệt quan trọng trong đời sống sinh trưởng phát triển và hình thành năng suất của cây trồng. Thiếu nitơ, cây sinh trưởng kém, chlorophyll không được tổng hợp đầy đủ, lá vàng, đẻ nhánh và phân cành kém, sút giảm hoạt động quang hợp nên năng suất giảm. Nếu thừa nitơ cũng sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng đến sinh trưởng, phát triển và năng suất của cây trồng. như cây sinh trưởng mạnh thân lá tăng nhanh nên cây rất yếu, dễ đổ, thu hoạch gặp nhiều khó khăn. 1.3. Quá trình chuyển hóa nitơ trong tự nhiên 1.3.1. Quá trình khoáng hóa Quá trình khoáng hóa là quá trình phân hủy xác hữu cơ dưới tác động của quần thể vi sinh vật thành các chất khoáng hòa tan hay các chất khí và tỏa nhiệt, tùy thuộc vào điều kiện khoáng hóa mà cho các sản phẩm khác nhau. Giai đoạn này có sự tham gia của các chủng vi sinh vật nitrat hóa như Nitrosomonas và Nitrobacter - những vi khuẩn tham gia vào quá trình oxy hóa những hợp chất chứa nitơ thành nitrat (NO3 -), một dạng thích hợp để cho cây trồng hấp thu. 1.3.2. Quá trình phản nitrat hóa Là quá trình phân hủy chuyển hóa hợp chất nitrat trong điều kiện yếm khí dưới tác dụng của vi sinh vật tạo thành nitơ. 1.3.3. Quá trình cố định nitơ phân tử Quá trình này được thực hiện do các vi sinh vật cố định nitơ như Rhizobium sống cộng sinh ở rễ cây họ đậu hay Azotobacter sống tự do, sẽ biến đổi N2 trong không khí thành NH3, từ NH3 sẽ tổng hợp ra các hợp chất chứa nitơ khác cung cấp cho cây trồng và đồng thời làm giàu thêm nitơ cho đất. Để quá trình này xảy ra thì phải có lực khử mạnh, ATP và thực hiện ở điều kiện kỵ khí (do chỉ trong điều kiện này enzyme nitrogenase mới hoạt động).
Cơ chế hóa sinh của quá trình cố định nitơ của vi khuẩn sống tự do trong đất. NO3 - Vi khuẩn phản nitrat hóa N2 N2 + H2 Nitrogenase Vi khuẩn cố định đạm NH3 H2O NH4 + NH4 + NO2 - Vi khuẩn nitrat hóa Nitrosomonas NO2 - NO3 - Nitrobacter Hợp chất hữu cơ Vi khuẩn amon hóa NH4 + Cơ chế hóa sinh của quá trình cố định N2 của vi sinh vật cho đến nay vẫn chưa được sáng tỏ hoàn toàn, nhưng đa số các nhà nghiên cứu đồng ý với giả thuyết cho rằng NH3 là sản phẩm đồng hóa sơ cấp của N2 và có thể nêu ra giả thuyết về 2 con đường cố định N2 của vi khuẩn sống tự do trong đất như sau: Trong công nghiệp, nhờ các chất xúc tác nên năng lượng dùng cho phản ứng cố định N2 được giảm nhiều, chỉ vào khoảng 16 – 20 Kcal/M, song lượng năng lượng vẫn còn lớn so với trong cơ thể sinh vật. Tốc độ phản ứng nhanh chóng trong tế bào vi sinh vật ở nhiệt độ thấp nhờ có hệ thống hydrogenase hoạt hóa H2 và nitrogenase hoạt hóa N2. Năm 1961 – 1962, người ta đã tách từ Clostridium pasteurrianum hai tiểu phần hoạt hóa H2 và N2. Sau này người ta tìm thấy ở Azotobacter cũng có các tiểu phần đó. Trong quá trình hoạt hóa này có sự tham gia của 2 nguyên tố khoáng Mo và Fe. Nguồn hydro để khử N2 có thể là hydro phân tử (H2). Trong trường hợp này thì dưới tác dụng của hydrogenase, điện tử được chuyền theo hệ thống: Nguồn cho điện tử và hydro là acid pyruvic. Đáng chú ý là trong quá trình chuyền điện tử có sự tham gia tích cực của feredoxine (Fd). Fd là cầu nối giữa 2 hệ enzyme hydrogenase và nitrogenase để cố định N2. Sự cố định N2 của vi khuẩn nốt sần có thể xảy ra theo sơ đồ phức tạp hơn. Trong các nốt sần có một chất có bản chất HEM rất giống với hemoglobin trong máu gọi là leghemoglobin. Nó dễ dàng liên kết với O2 để biến thành oxyhemoglobin. Leghemoglobin chỉ được tạo nên khi vi khuẩn sống cộng sinh với cây bộ đậu, còn khi nuôi cấy tinh khiết các Rhizobium sẽ không tạo leghemoglobin và không cố định được N2. Những nghiên cứu gần đây về quá trình cố định N2 cho thấy quá trình cố định này đòi hỏi: Có sự tham gia của enzyme nitrogenase. Có thể coi đây là nhân tố chìa khóa cho quá trình này. Enzyme này hoạt động trong điều kiện yếm khí. Có lực khử mạnh với thế năng khử cao (NAD, NADP,...) Có năng lượng ATP đủ và có sự tham gia của nguyên tố vi lượng. Nhóm hoạt động của enzyme nitrogenase có chứa Mo và Fe. Vì vậy sử dụng Mo và Fe cho cây họ đậu thường có hiệu quả rất cao. Tiến hành trong điều kiện yếm khí. Các chất khử là NADH2 và Fd cùng với năng lượng do hô hấp, quang hợp của cây chủ cung cấp. Sự cố định N2 cần rất nhiều năng lượng, cần 16 ATP để khử 1 N2. NH3 tạo thành trong quá trình cố định N2 được sử dụng dễ dàng vào quá trình amine hóa các cetoacid để tổng hợp một cách nhanh chóng các acid amine, từ đó tham gia vào tổng hợp protein và nhiều quá trình trao đổi chất khác. Phản ứng cố định nitơ được xúc tác bởi enzyme nitrogenase theo phương trình sau: N2 + 8 H + + 8 e- +16 ATP → 2 NH3 + H2 +16 ADP +16 Pi Như phương trình trên, nitrogenase xúc tác cho phản ứng khử N2 thành NH3 trong sự hiện diện của ATP và chất khử như dithionite trong phòng thí nghiệm hay ferredoxin trong cơ thể sống. Nitrogenase là một phức hệ enzyme được cấu tạo bởi 2 thành phần, đó là protein có phân tử nhỏ. Một thành phần gọi là protein sắt – molypden (Mo – Fe protein) còn gọi là thành phần I, thành phần kia gọi là protein sắt (Fe protein), còn gọi là nitrogenase khử hay thành phần II. Thành phần I và thành phần II của nitrogenase đều rất mẫn cảm với oxy, vì vậy nên hoạt động cố định nitơ của vi sinh vật diễn ra trong điều kiện kỵ khí [18]. 1.4 . Tổng quan về vi khuẩn cố định Nitơ Người ta nhận thấy muốn thu hoạch 12 tạ hạt trên mỗi hecta, cây trồng lấy đi khỏi đất khoảng 30 kg nitơ [3]. Theo thống kê hàng năm các sản phẩm nông nghiệp trên thế giới lấy đi khỏi đất khoảng 100 – 110 triệu tấn nitơ (G. Colar và Greenland) [3]. Trong khi đó lượng phân nitơ hóa học hiện nay chỉ bù đắp được một phần lượng nitơ mà cây lấy đi khỏi đất, những tổn thất về nitơ được bù đắp bởi một quá trình sinh học đặc biệt gọi là quá trình cố định nitơ do vi sinh vật thực hiện, chúng có khả năng chuyển hóa nitơ phân tử trong không khí thành các hợp chất chứa nitơ và làm giàu thêm nguồn đạm trong đất, có thể xếp chúng thành ba nhóm lớn: + Nhóm vi sinh vật sống cộng sinh với thực vật. + Nhóm vi khuẩn sống tự do. + Nhóm vi khuẩn lam. 1.4.1. Nhóm Vi sinh vật sống cộng sinh với thực vật 1.4.1.1. Vi khuẩn nốt sần cộng sinh với cây bộ đậu Nhà khoa học Hà Lan M.W. Beijrinck đã phân lập được loài vi khuẩn sống cộng sinh trong nốt sần ở rễ một cây thuộc bộ đậu và ông đặt tên là Bacillus radicicola, vi khuẩn này được xếp vào chi riêng Rhizodium. Trên môi trường đặc, vi khuẩn nốt sần thường có khuẩn lạc trơn bóng, nhầy, vô màu. Khi còn non tế bào của chúng có dạng hình que hoặc cầu 0,5 – 0,9 x 1,2 – 3,0µm, có khả năng di động nhờ tiêu mao; khi già tế bào trở nên bất động kích thước lớn phân nhánh gọi là thể giả khuẩn [3], [8]. Đây là các loài hiếu khí, tuy nhiên vi khuẩn nốt sần vẫn có thể sử dụng được ngay cả ở trong trường hợp chỉ có một áp lực oxy rất thấp khoảng 0.01atm. đa số chúng thích hợp ở pH = 6,5 – 7,5, bị cản trở khi pH= 4,5 – 5,0 hoặc lớn hơn 8.0 nhiệt độ thích hợp 24 – 26 o C, ở 37 o C sự phát triển của chúng bị cản trở [6], [7]. Vi khuẩn nốt sần xâm nhiễm vào rễ cây bộ đậu thông qua lông hút, đôi khi thông qua vết thương ở vỏ rễ. Người ta nhận thấy muốn xâm nhiễm tốt thì vi khuẩn nốt sần cần đạt tới 104 tế bào/gam đất. Dưới ảnh hưởng của vi khuẩn, rễ tiết ra enzyme polylacturonase phân hủy thành lông hút, tạo điều kiện cho vi khuẩn xâm nhập vào rễ. Hằng năm vi khuẩn nốt sần cộng sinh trong rễ cây bộ đậu có thể làm giàu cho đất khoảng 50 – 600 kg nitơ/ha [3]. 1.4.1.2. Vi sinh vật cố định đạm cộng sinh trong một số cây không thuộc bộ đậu Ngoài những loại cây thuộc bộ đậu thì những loài cây không thuộc bộ đậu cũng có khả năng tạo nốt sần như: một số thực vật thuộc ngành hạt trần: Bowenia, Cycas...một số thực vật hai lá mầm: Coffee, Coriaria,... Ngoài ra một số thực vật còn có khả năng tạo nốt sần trên lá. Qua nghiên cứu cho thấy, ngoài vi khuẩn nốt sần một số loài xạ khuẩn thuộc chi Frankia (cộng sinh trong rễ loài Casuarina) nhiều loài nấm rễ (khuẩn căn hay mycorhiza ) cũng có khả năng cố định nitơ phân tử, tạo nốt sần. Có nhiều nghiên cứu cho thấy, nhờ tác dụng của nấm rễ mà đất thông Pinus radiala ở Mỹ hằng năm làm giàu thêm khoảng 50 kg nitơ/ha [3]. Ngày nay, các nhà khoa học có thể phân lập, nuôi cấy vi khuẩn cố định nitơ cộng sinh Rhizobium để sản xuất chế phẩm Nitragin để xử lý hạt giống đậu trước khi gieo. Vi khuẩn sẽ được nuôi cấy trên môi trường thích hợp sau đó hấp phụ vào chất mang là đất, than bùn để bảo quản và sử dụng. 1.4.2. Nhóm Vi khuẩn cố định nitơ tự do 1.4.2.1. Vi khuẩn cố định nitơ tự do kỵ khí Clostridium Clostridium được phát hiện lần đầu tiên bởi Vinogradxki (1893). Tế bào Clostridium hình que có kích thước 2,5 – 7,5 x 0,7 – 1,3 µm, có thể đứng riêng rẽ hoặc kẹp đôi thành chuỗi ngắn. Khi còn non có khả năng di động, khi già mất khả năng di động, bào tử nằm ở trung tâm, khuẩn lạc nhẵn và trắng có khả năng chịu được nhiệt độ cao và khô hạn [5]. Vi khuẩn Clostridium có nhiều loài có khả năng cố định nitơ phân tử như: Cl. pasteurianum, Cl. butylicum .... nhưng loài có khả năng cố định đạm cao nhất là Clostridium pasteurianum. Chúng có khả năng cố định được 5 – 10 mg nitơ khi tiêu thụ hết 1g carbon. Phạm vi hoạt động cố định nitơ của Clostridium trong khoảng pH khá rộng 4,7 – 8,5, tối thích là 6,9 – 7,3. 1.4.2.2. Vi khuẩn cố định nitơ tự do hiếu khí Nhóm này gồm hai chi chính là Beijerinskia sp. và Azotobacter sp. 1.4.2.2.1. Nhóm vi khuẩn thuộc chi Beijerinskia sp. Beijerinskia sp. là loài vi khuẩn hiếu khí cố định nitơ rất giống với Azotobacter sp. Chúng được phân lập bởi R. J. Starkey (1939), tế bào có hình dạng thay đổi như hình cầu, hình que, hình bầu dục. Beijerinski là vi khuẩn gram âm, không sinh bào tử và bào xác, đặc điểm chung của vi khuẩn thuộc chi này là chịu chua cao. Có khả năng sống tốt tro