Sử dụng kỹ thuật rflp xác định sự đa dạng di truyền của nấm metarrhizium anisopliae và nấm beauveria bassiana ký sinh trên côn trùng gây hại

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** TRẦN NHƢ NGỌC SỬ DỤNG KỸ THUẬT RFLP XÁC ĐỊNH SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NẤM Metarrhizium anisopliae VÀ NẤM Beauveria bassiana KÝ SINH TRÊN CÔN TRÙNG GÂY HẠI LUẬN VĂN: KĨ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SỬ DỤNG KỸ THUẬT RFLP XÁC ĐỊNH SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NẤM Metarrhizium anisopliae VÀ NẤM Beauveria bassiana KÝ SINH TRÊN CÔN TRÙNG GÂY HẠI LUẬN VĂN: KĨ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC GIÁO VIÊN HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN VÕ THỊ THU OANH TRẦN NHƢ NGỌC KHÓA: 28 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC FACULTY OF BIOTECHNOLOGY ***000*** RFLP ANALYSIS OF POLYMORPHISMS IN Metarrhizium anisopliae AND Beauveria bassiana ACCOSIATED WITH INSECT GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY PROFESSOR STUDEN VÕ THỊ THU OANH TRẦN NHƢ NGỌC TERM: 28 HCMC 9/2006 iii LỜI CẢM TẠ Xin chân thành gửi lời cảm tạ đến:  Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.  Ban chủ nghiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho chúng tôi.  ThS. Võ Thị Thu Oanh đã hƣớng dẫn tận tình cho tôi trong suốt quá trình thực tập và giúp tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.  TS. Bùi Minh Trí –Trƣởng trung tâm phân tích Hóa – Sinh trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.  Phòng thí nghiệm Hóa – Sinh thuộc Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Trƣờng Đại Học Nông Lâm.  Các anh chị làm việc tại Trung Tâm Phân Tích Hóa – Sinh, đặc biệt gửi lời cảm ơn chân thành đến chị Hƣng đã hết lòng giúp đỡ, chia sẽ và động viên tôi trong suốt thời gian làm khóa luận.  Các bạn sinh viên thực tập tại phòng 105 – khu Phƣợng Vĩ Trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã giúp đỡ tôi.  Các bạn bè thân yêu của lớp Công Nghệ Sinh Học K28 đã chia sẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng nhƣ hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập. TÓM TẮT Đề tài nghiên cứu:“ sử dụng kỹ thuật RFLP xác định sự đa dạng di truyền của hai dòng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana” ký sinh trên côn trùng gây hại ” đƣợc thực hiện từ ngày 20 tháng 2 năm 2005 đến ngày 15 tháng 8 năm 2005 tại trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh. Đề tài do Trần Nhƣ Ngọc thực hiện dƣới sự hƣớng dẫn của ThS. Võ Thị Thu Oanh Đối tƣợng nghiên cứu là nấm Metarrhizium anisopliae và nấm Beauveria bassiana ký sinh trên côn trùng gây hại. Nấm này có tác dụng tiết ra độc tố làm ngừng hoạt động của ruột, phá vở các hoạt động bình thƣờng của côn trùng dẫn đến côn trùng bị chết khô Mục đích đề tài nhằm xác định đoạn gen gây độc Pr1 của những dòng nấm Metarrhizium anisopliae và vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 của nấm Beauveria bassiana giúp chọn lọc đúng những dòng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana có tính độc đảm bảo hoạt tính diệt côn trùng lâu dài và hiệu quả nhằm phục vụ cho sản xuất nông nghiệp . Các nội dung nghiên cứu bao gồm: 1. Phục hồi các chủng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassian trên một số côn trùng gây hại . 2. Dùng kỹ thuật PCR phát hiện gen protease (Pr1) và vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 liên quan đến tính độc của hai dòng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana.. 3. Sau khi thöïc hieän phaûn öùng PCR ta söû duïng kỹ thuật RFLP thực hiện phaûn öùng enzyme caét giôùi haïn ñeå phaùt hieän söï ña hình trong phaïm vi vuøng IST1-5.8S-IST2 cuûa naám Beauveria bassiana vaø vuøng Pr1 cuûa naám Metarrhizium anisopliae 4. Giải trình tự đoạn gen Pr1 và vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 so sánh trình tự này với các mẫu trên ngân hàng gen thế giới (genbank). Kết quả thu đƣợc nhƣ sau: 1.Phục hồi các dòng nấm Metarrhizium và Beauveria trên môi PGA: Sau quá trình phục hồi các nguồn nấm trên môi trƣờng PGA(Potato-Glucose- Agar),kết quả chúng tôi đã thu đƣợc một số dòng nấm sau khoảng 7-10 ngày nuôi cấy : RNBT1.7 ,DONG 3.1, BXĐTG6, RMTĐ3 ,PULQ2, NNPT7, SR, BRVT6 ,BHBD6 ,SCLLLA1, BDTN4 ,BDQ96 . 2.Nhân sinh khối các dòng nấm Metarrhizium và Beauveria trong môi trƣờng lỏng Czapek – Dox trong khoảng thời gian từ 3-5 ngày , thu đƣợc sinh khối nấm ,rửa lại với nƣớc cất rồi phơi khô , nghiền trong nitơ lỏng ,cuối cùng chúng tôi đƣợc nấm ở dạng khô và chúng tôi bảo quản nấm -800C cho đến khi sử dụng . 3.Tiến hành ly trích nấm đã bảo quản ở trên bằng dịch ly trích ,kết quả trích đƣợc DNA của 12 dòng nấm Metarrhizium và Beauveria ,sau đó là tinh sạch DNA của các dòng nấm Metarrhizium và Beauveria nhằm tạo sản phẩm sạch ,ít tạp trong sản phẩm PCR.Sau tinh sạch vẫn giữ đƣợc DNA của 12 mẫu nấm. 4.Thực hiện phản ứng PCR trên các dòng nấm Metarrhizium và Beauveria , kết quả thu đƣợc sản phẩm PCR của 6 dòng nấm Beauveria 5.Phân tích RFLP , thực hiện phản ứng cắt bằng enzyme cắt giới hạn trên 6 dòng nấm Beauveria ,enzyme cắt Alu I, Hae III trên các sản phẩm PCR .kếtquả chƣa nhận thấy rõ sự đa dạng di truyền của các dòng nấm do mức độ tƣơng đồng giữa các dòng nấm khá cao .Tuy nhiên thu đƣợc kích thƣớc các band trên gel so với Ladder là hoàn toàn trùng khớp với kích thƣớc band DNA chuẩn của các dòng nấm Beauveria . MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm tạ ..................................................................................................................... iii Tóm tắt ........................................................................................................................... iv Mụclục ............................................................................................................................ vi Danh sách chữ viết tắt .................................................................................................... ix Danh sách các bảng ......................................................................................................... x Danh sách các hình ........................................................................................................ xi 1. MỞ ĐẦU .................................................................................................................. 1 1.1.Đặt vấn đề .............................................................................................................. 1 1.2.Mục đích và yêu cầu đề tài ................................................................................... 1 1.2.1.Mục đích ...................................................................................................... 1 1.2.2.Mục tiêu ...................................................................................................... 2 1.3.Yêu cầu nghiên cứu ............................................................................................... 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................................... 3 2.1.Vai trò của biện pháp phòng trừ sinh học.............................................................. 3 2.2.Giới thiệu về nấm ký sinh ...................................................................................... 4 2.2.1.Giới thiệu về nấm Metarrhizium anisopliae .............................................. 5 2.2.2.Giới thiệu về nấm Beauveria bassiana vuille............................................. 6 2.3.Hiệu quả phòng trừ bằng chế phẩm nấm ............................................................... 8 2.4.Sơ lƣợc về phƣơng thức xâm nhiễm ...................................................................... 9 2.5.Hoạt tính sinh học ................................................................................................ 11 2.6.Một số nghiên cứu trong và ngoài nƣớc ............................................................. 11 2.6.1.Nghiên cứu trong nƣớc ............................................................................. 11 2.6.2.Nghiên cứu ngoài nƣớc ............................................................................ 12 2.7.Vai trò của protease Pr1 và vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 ........................................ 14 2.8.Phản ứng PCR ..................................................................................................... 14 2.8.1.Giới thiệu chung về PCR .......................................................................... 14 2.8.2.Các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả PCR ................................................... 15 2.8.3.Các ứng dụng của phƣơng pháp PCR ...................................................... 16 2.8.4. Những hạn chế của phƣơng pháp PCR ................................................... 16 2.9. Đọc trình tự bằng máy đọc tự động .................................................................. 17 2.10.Phân tích RFLP ................................................................................................. 17 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................................. 19 3.1.Thời gian và địa điểm ........................................................................................ 19 3.1.1.Thời gian .................................................................................................. 19 3.1.2.Địa điểm .................................................................................................. 19 3.2. Vật liệu và hóa chất .......................................................................................... 19 3.2.1.Vật liệu ..................................................................................................... 19 3.2.1.1.Mẫu thí nghiệm............................................................................. 19 3.2.1.2.Các Primer dùng trong thí nghịêm ............................................... 19 3.2.2.Hóa chất và môi trƣờng ........................................................................... 19 3.2.2.1.Các hóa chất dùng chiết tách DNA từ khối sợi nấm ................... 19 3.2.2.2. Các hóa chất dùng trong điện di .................................................. 20 3.2.2.3. Các hóa chất dùng trong phản ứng PCR ..................................... 20 3.2.2.4.Môi trƣờng ................................................................................... 20 3.2.3.Các thiết bị chính ...................................................................................... 21 3.3.Nôi dung nghiên cứu ......................................................................................... 21 3.4.Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................................... 21 3.4.1.Phục hồi các chủng nấm ........................................................................... 21 3.4.2.Chủân bị môi trƣờng lỏng ....................................................................... 22 3.4.3.Phƣơng pháp ly trích DNA ....................................................................... 22 3.4.4.Phƣơng pháp tinh sạch DNA .................................................................... 23 3.4.5.Thực hiên phản ứng PCR ......................................................................... 24 3.4.5.1.Nấm Metarrhizium anisopliae ..................................................... 24 3.4.5.2.Nấm Beauveria bassiana vuille ................................................... 25 3.4.6.Điện di và đọc kết quả ............................................................................. 26 3.4.6.1.Điện di trên gel agarose .............................................................. 26 3.4.6.2.Đọc kết quả điện di .................................................................... 26 3.4.7.Thành phần phản ứng đọc trình tự .......................................................... 27 3.4.7.1.Tinh sạch sản phẩm PCR ............................................................ 27 3.4.7.2.Thành phần phản ứng đọc trình tự ............................................ 27 3.4.8.Tinh sạch sản phẩm đọc trình tự .............................................................. 28 3.4.9.Điện di và ghi nhân kết quả ..................................................................... 29 3.4.10. Phân tích RFLP ..................................................................................... 29 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................................. 30 4.1. Kết quả phục hồi và nhân sinh khối nấm .......................................................... 30 4.2. Kết quả ly trích DNA ....................................................................................... 30 4.3. Kết quả tinh sạch DNA .................................................................................... 32 4.4. Kết quả PCR ..................................................................................................... 33 4.5. Kết quả phân tích RFLP ................................................................................... 34 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................................. 36 5.1.Kết luận............................................................................................................... 36 5.2.Đề nghị .............................................................................................................. 36 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 37 DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1 Chế phẩm sinh học từ nấm Beauveria và Metarrhizium ...................... 9 Hình 2.2 Nấm Beauveria bassiana vuille ký sinh trên ong .......................... 13 Hình 4.1 Nấm Beauveria và Metarrhizium ...................................................... 30 Hình 4.2 Kết quả ly trích ................................................................................... 31 Hình 4.3 Kết quả tinh sạch ................................................................................ 32 Hình 4.4:Kết quả PCR ....................................................................................... 34 Hình 4.5:Kết quả phân tích RFLP ..................................................................... 35 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT BDQ96 : Bọ dừa Quận 9 6 BDTN4 : Bọ dừa Tây Ninh 4 SCLLLA1 : Sâu cuốn lá lúa Long An 1 RNBT1.7 : Rầy nâu Bến Tre 1.7 DONG3.1 : Dòng 3.1 BXĐTG6 : Bọ xít đen Tiền Giang 6 RMTĐ3 : Rầy mềm Thủ Đức 3 PULQ2 : Rệp vải mềm nâu tím Quận 2 SR : Sâu róm BRVT6 : Bọ rầy Vũng Tàu 6 BHBD6 : Bọ hà Bình Dƣơng 6 PM : pico mol Ng : nano gram nm : nano mol g : micro gram m : micro mol M : micro mol/lít l : micro lít TE : tris EDTA dNTP : deoxyribonucleotide – 5 – trphosphate TAE : tris acetic EDTA UI : unit international bp : base pair Kb : kilo base CZA : Czapek – Dox SDS : Sodium dodecyl sulphate PGA : Potato glucose agar SDA : Soduim dedocyl sulphate RFLP : Restriction Fragment Lengh Polymorphism RAPD : Random Amlification of Polymorphic DNA Tm : melting temperature PCR : Polymerase Chains Reaction RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism EDTA : Ethylene Diamine Tetracetic Acid ITS : Intenal Transcribed Spacer Taq : Thermus aquaticus TAE : Tricacetic ethylene diamine tetra acetat TE : Tris ethylene diamine tetra acetate ix DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 3.1:Thành phần phản ứng PCR ở nấm Metarrhizium ................................ 24 Bảng 3.2:Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR ở nấm Metarrhizium .............................. 25 Bảng 3.3: Thành phần phản ứng PCR ở nấm Beauveria .................................... 25 Bảng 3.4:Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR ở nấm Beauveria .................................... 26 Bảng 3.5:Thành phần phản ứng đọc trình tự ....................................................... 28 Bảng 3.6:Quy trình chung phản ứng cắt .............................................................. 29 1 Phần 1. MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Ngày nay với tốc độ phát triển nhƣ vũ bão của khoa học và công nghệ đã kéo theo hàng loạt những thay đổi trong đời sống xã hội của con ngƣời: kinh tế, chính trị, xã hội,… rồi đến đời sống vật chất, tinh thần,… Thông qua đó đặt ra một vấn đề hết sức cấp thiết làm sao giải quyết tốt vấn đề lƣơng thực thực phẩm cho con ngƣời. Thực tế cho thấy việc áp dụng thành công trong khoa học – công nghệ vào sản xuất nông nghịêp nhằm nâng cao năng xuất cây trồng đã đƣợc ứng dụng từ nhiều năm nay và đã đem lại nhiều kết quả đáng kể nhƣ: tạo giống bƣởi không hạt, bƣởi da xanh có chất lƣợng tốt, mùi vị ngon, ngọt và không xử lý hóa chất (Viện Cây Ăn Quả Miền Nam); hay tạo giống lúa ngắn ngày có khả năng chống chịu tốt, hạt gạo mềm, dẻo, thơm, đặc biệt là năng suất tăng so với nhiều giống trƣớc đó bằng việc xử lý yếu tố di truyền trong gen (Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long )….Đây chính là những thành tựu trong lĩnh vực Bảo Vệ Thực Vật nói chung và của Công nghệ Sinh học nói riêng . Chính vì tính chất quan trọng của ngành Bảo Vệ Thực Vật (cũng nhƣ Công Nghệ Sinh Hoc) trong Nông Nghiệp và đời sống, nên chúng tôi đã thực hiện đề tài “Sử dụng kỹ thuật RFLP xác định sự đa dạng di truyền của các dòng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria basiana ký sinh trên côn trùng gây hại”. Từ việc xác định chính xác trình tự của nucleotide trên gen phát sinh độc tố của nấm ký sinh trên côn trùng gây hại cho hoa màu, ta có thể chủ động hơn trong quá trình tác động lên gen gây độc, nhằm diệt nấm đạt hiệu quả cao nhất, giảm thiệt hại do côn trùng phá hoại, nâng cao năng suất cây trồng, tạo sản phẩm sạch, an toàn và thân thiện với môi trƣờng. 1.2. Mục đích và yêu cầu đề tài 1.2.1. Mục đích Làm cơ sở khoa học cho việc xác định đa dạng di truyền và xác định gen gây độc nhằm tạo ra đƣợc thuốc trừ sâu sinh học có hoạt tính ổn định và hiệu quả đối với từng loại cây trồng, đáp ứng nhu cầu trong công tác bảo vệ thực vật hiện nay. 2 1.2.2. Mục tiêu Bằng kỹ thuật RFLP và đọc trình tự cho phép xác định gen Pr1 và vùng gen ITS1 - 5.8S - ITS2 sau đó tìm sự khác biệt trong trình tự nucleotide của đoạn gen Pr1 giữa các dòng nấm Metarrhizium anisopliae, và trình tự nucleotide của vùng gen ITS1- 5.8S -ITS2 giữa các dòng nấm Beauveria bassiana. 1.2.3. Yêu cầu nghiên cứu Phục hồi các dòng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana từ nhiều cây trồng khác nhau. Phát hiện gen gây độc Pr1 của nấm Metarrhizium anisopliae và vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 của nấm Beauveria bassiana bằng phƣơng pháp PCR. Sử dụng kỹ thuật RFLP thực hiện phản ứng enzyme cắt giới hạn để phát hiện sự đa hình trong phạm vi vùng gen độc Pr1 của các dòng nấm Metarrhizium anisopliae và ITS1 – 5.8S – ITS2 của các dòng nấm Beauveria bassiana. Xác định trình tự nucleotide của vùng gen gây độc Pr1 và ITS1 – 5.8S – ITS2 trên hai dòng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria basisiana. 1.3. Đối tƣợng nghiên cứu Một số loài thuộc hai dòng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana vuille thu thập ở các tỉnh thành khác nhau nhƣ: Long An, Trà Vinh, Tây Ninh, Tiền Giang, Bến Tre, Quận 2 thành phố Hồ Chí Minh, Quận 9 thành phố Hồ Chí Minh gây hại cho côn trùng trên các đối tƣợng cây trồng khác nhau. 3 Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Vai trò của biện pháp phòng trừ sinh học trong bảo vệ thực vật hiện nay Dƣới áp lực tạo ra nguồn sản phẩm nông nghiệp với sản lƣợng cao, chất lƣợng tốt, giảm giá thành và giảm ảnh hƣởng đến môi trƣờng, chúng ta phải tăng cƣờng sử dụng biện pháp sinh học một cách có hệ thống. Quản lý dịch hại tổng hợp (IPM) trên cây trồng nông lâm nghiệp theo định hƣớng tăng cƣờng sử dụng các tác nhân sinh học và chế phẩm có nguồn