Ứng dụng phương pháp mặt đáp ứng để tối ưu quá trình thủy phân protein trên đầu tôm thè chân trắng bằng enzyme Alcalse

i LỜI CẢM ƠN Để có thể hoàn thành tốt đề tài khóa luận tốt nghiệp, ngoài nỗ lực của bản thân còn có sự giúp đỡ tận tình của những người đi trước, em xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến những người đã giúp đỡ em trong suốt thời gian qua, nhất là thời gian 3 tháng thực tập trên phòng thí nghiệm. Đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy PGS.Ts Ngô Đăng Nghĩa, cô Th.S Ngô Thị Hoài Dương đã luôn bên em, trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu để em có thể từng bước hoàn thành tốt đề tài. Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn các thầy cô trong trường, nhất là các thầy cô trong khoa công nghệ thực phẩm, bộ môn công nghệ chế biến đã trực tiếp giảng dạy, truyền đạt kiến thức trong suốt thời gian em theo học tại nhà trường. Em xin chân thành cảm ơn đến các thầy, cô phụ trách phòng thí nghiệm Hóa sinh – vi sinh thực phẩm, cùng thầy cô bộ môn quản lý chất lượng và an toàn thực phẩm, bộ môn công nghệ lạnh, các anh chị trung tâm công nghệ sinh học và Trung tâm ứng dụng công nghệ chế biến trường Đại học Nha Trang đã tạo điều kiện thuận lợi trong suốt thời gian thực tập. Em chân thành cảm ơn chị Ngọc Hoài sinh viên cao học thạc sĩ, các bạn sinh viên lớp 50CBTS, cùng toàn thể các bạn sinh viên thực tập tại phòng thí nghiệm đã nhiệt tình giúp đỡ động viên em. Cuối cùng con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến bố, mẹ kính mến cùng anh chị em thân yêu, những người đã ủng hộ nhiệt tình cả vật chất lẫn tinh thần trong quá trình học tập và thực hiện đề tài. Nha Trang, ngày 10 tháng 07 năm 2012 Sinh viên Nguyễn Hồng Anh Diễm ii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN ..........................................................................................................i MỤC LỤC ..............................................................................................................ii DANH MỤC CÁC BẢNG ......................................................................................v DANH MỤC CÁC HÌNH ......................................................................................vi DANH MỤC CÁC HÌNH ......................................................................................vi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ...............................................................................viii LỜI MỞ ĐẦU .........................................................................................................1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ...................................................................................3 1.1. Khái quát về phế liệu tôm .............................................................................3 1.1.1. Tình hình nuôi trồng, chế biến và xuất khẩu tôm Việt Nam....................3 1.1.2. Sản lượng phế liệu tôm trong chế biến thủy sản .....................................4 1.1.3. Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng của phế liệu tôm ...................5 1.1.3.1. Thành phần hóa học của phế liệu tôm ..............................................5 1.1.4. Các hướng tận dụng phế liệu tôm ...........................................................6 1.1.4.1. Sản xuất thức ăn chăn nuôi ...............................................................7 1.1.4.2. Sản xuất chitin – chitosan và các dẫn xuất khác của chitin................7 1.1.4.3. Sản xuất màu Astaxanthin ................................................................8 1.1.4.4. Làm các sản phẩm định hình ............................................................8 1.1.4.5. Sản phẩm súp và canh, mắm tôm và gia vị .......................................8 1.2. Enzyme protease và quá trình thủy phân protein...........................................8 1.2.1. Enzyme protease ...................................................................................8 1.2.1.1. Phân loại protease ............................................................................9 1.2.1.2. Nguồn thu nhận protease ................................................................10 1.2.1.3. Cơ chế tác dụng của protease .........................................................10 1.2.1.4. Hoạt độ enzyme .............................................................................11 1.2.1.5. Enzyme Alcalase ............................................................................12 1.2.1.6. Hệ enzyme protease của tôm ..........................................................12 iii 1.2.2. Quá trình thủy phân protein bằng enzyme protease ..............................14 1.2.2.1. Protein thủy phân ..........................................................................14 1.2.2.2. Phương pháp sản xuất protein thủy phân .......................................16 1.2.2.3. Giá trị dinh dưỡng và hoạt tính sinh học của dịch thủy phân protein .......................................................................................................16 1.2.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân protein ..................17 1.3. Giới thiệu về phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) ....................................19 1.3.1. Nguyên tắc ..........................................................................................20 1.3.2. Công dụng của RMS ...........................................................................21 1.3.3. Ưu, nhược điểm của RMS ...................................................................22 1.3.4. Các mô hình thí nghiệm trong RMS .....................................................22 1.3.4.1. Thiết kế Box-Behnken (BBD) .......................................................22 1.3.4.2. Thiết kế Central composit (CCD) ..................................................23 1.4. Các nghiên cứu và ứng dụng nguyên liệu còn lại từ nguyên liệu tôm..........25 1.4.1. Trên thế giới.........................................................................................25 1.4.2. Ở Việt Nam..........................................................................................27 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................28 2.1. Đối tượng nghiên cứu .................................................................................28 2.1.1. Nguyên liệu đầu tôm ............................................................................28 2.1.2. Enzyme Alcalase..................................................................................28 2.1.3. Hóa chất...............................................................................................28 2.2. Phương pháp nghiên cứu và xử lý số liệu ...................................................28 2.2.1. Phương pháp nghiên cứu ......................................................................28 2.2.1.1. Phương pháp thu nhận mẫu ............................................................28 2.2.1.2. Phương pháp phân tích các chỉ tiêu ................................................29 2.3. BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM ..............................................................................30 2.3.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát .........................................................30 2.3.2. Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt cho nguyên liệu trước khi thủy phân và việc bổ sung enzyme đến sự thủy phân protein trên đầu tôm thẻ chân trắng ........................................................31 iv 2.3.3. Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của các nhân tố đến quá trình thủy phân protein trên đầu tôm thẻ chân trắng ................................................33 2.3.4. Bố trí thí nghiệm tối ưu hóa quá trình thủy phân protein bằng enzyme Alcalase trên đầu tôm thẻ chân trắng .................................................34 2.3.5. Bố trí thí nghiệm đặc trưng tính chất của dịch thủy phân protein thu được..... 37 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................................39 3.1. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt và bổ sung enzyme Alcalase đến khả năng thủy phân protein trên đầu tôm thẻ chân trắng............................ 39 3.1.1. Ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt và bổ sung enzyme đến hàm lượng protein hòa tan trong dịch thủy phân protein thu được..........................39 3.1.2. Ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt và bổ sung enzyme đến khả năng chống oxi hóa của dịch thủy phân protein thu được................................41 3.1.3. Ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt và bổ sung enzyme đến hiệu suất khử protein còn lại trên bã.......................................................................43 3.2. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của các nhân tố đến quá trình thủy phân protein trên đầu tôm thẻ chân trắng ....................................................................44 3.2.1. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của các nhân tố đến hàm lượng protein hòa tan của dịch thủy phân .............................................................................44 3.2.2. Ảnh hưởng của các yếu tố đến khả năng chống oxi hóa của dịch thủy phân .......................................................................................................50 3.3. Kết quả tối ưu hóa quá trình thủy phân protein bằng enzyme Alcalase trên đầu tôm thẻ chân trắng ................................................................................56 3.4. Kết quả đặc trưng tính chất dịch thủy phân protein thu được ......................70 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN...............................................73 4.1. Kết luận......................................................................................................73 4.2. Đề xuất ý kiến ............................................................................................73 TÀI LIỆU THAM KHẢO .....................................................................................74 PHỤ LỤC................................................................................................................1 v DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Thành phần hóa học cơ bản của phế liệu tôm Penaeus vannamei ............. 6 Bảng 2.2. Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của các nhân tố đến quá trình thủy phân protein trên đầu tôm cho các giá trị ở biên............................................. 33 Bảng 2.3. Bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của các nhân tố đến quá trình thủy phân protein trên đầu tôm ở tâm phương án ................................................... 34 Bảng 2.4. Mức thí nghiệm của các yếu tố cho thí nghiệm tối ưu hóa quá trình thủy phân protein trên đầu tôm .............................................................................. 35 Bảng 2.5. Bố trí thí nghiệm tối ưu hóa quá trình thủy phân protein trên đầu tôm theo RMS-CCD .............................................................................................. 36 Bảng 3.1. Bảng Effect list cho hàm mục tiêu hàm lượng protein hòa tan ............... 44 Bảng 3.2. Bảng Effect list cho hàm mục tiêu nồng độ DPPH bị khử ...................... 50 Bảng 3.4. Kết quả ma trận quy hoạch thực nghiệm theo RMS-CCD ...................... 57 Bảng 3.5. Bảng FIT SUMMARY đối với hàm mục tiêu hàm lượng protein hòa tan ........ 58 Bảng 3.6. Bảng FIT SUMMARY đối với hàm mục tiêu nồng độ DPPH bị khử. .... 58 Bảng 3.7. Bảng FIT SUMMARY đối với hàm mục tiêu hiệu suất khử protein còn lại trên bã........................................................................................................ 58 Bảng 3.8. Kết quả phân tích ANOVA.................................................................... 59 Bảng 3.9. Bảng tổng hợp các tiêu chí lựa chọn chế độ xử lý tối ưu cho quá trình thủy phân protein trên đầu tôm. .....................................................................67 Bảng 3.10. Nhận xét cảm quan dịch thủy phân protein từ đầu tôm......................... 70 Bảng 3.11. Một số chỉ tiêu sinh hóa học của dịch thủy phân protein từ đầu tôm .... 71 Bảng 3.12. Thành phần % các axit béo .................................................................. 71 vi DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Phản ứng thủy phân xúc tác bởi protease................................................11 Hình 1.2. Phản ứng thủy phân protein....................................................................14 Hình 1.3. Sơ đồ chức năng chuyển đổi ..................................................................20 Hình 1.4. Biểu diễn hình thức của chức năng đáp ứng ...........................................21 Hình 1.5. Thiết kế Box-Behnken ...........................................................................23 Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát ...........................................................30 Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt và xử lý enzyme đến sự thủy phân protein trên đầu tôm thẻ chân trắng .........32 Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm đặc trưng tính chất dịch thủy phân protein.........37 Hình 3.1. Ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt và bổ sung enzyme đến hàm lượng protein hòa tan trong dịch thủy phân protein thu được .................................39 Hình 3.2. Ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt và bổ sung enzyme đến khả năng chống oxi hóa của dịch thủy phân protein thu được.......................................41 Hình 3.3. Ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt và bổ sung enzyme đến hiệu suất khử protein còn lại trên bã..............................................................................43 Hình 3.4. Đồ thị đánh giá mức độ ảnh hưởng của các yếu tố đến hàm lượng protein hòa tan của dịch thủy phân.........................................................................45 Hình 3.5. Đồ thị ảnh hưởng của yếu tố nồng độ enzyme, nhiệt độ thủy phân, thời gian thủy phân đến hàm lượng protein hòa tan................................................47 Hình 3.6. Đồ thị ảnh hưởng của tương tác giữa hai yếu tố nồng độ enzyme và nhiệt độ thủy phân đến hàm lượng protein hòa tan.................................................48 Hình 3.7. Đồ thị ảnh hưởng của tương tác giữa hai yếu tố nồng độ enzyme và thời gian thủy phân đến hàm lượng protein hòa tan ...............................................49 Hình 3.8. Đồ thị đánh giá mức độ ảnh hưởng của các yếu tố đến khả năng chống oxi hóa của dịch thủy phân..........................................................................51 vii Hình 3.9. Đồ thị ảnh hưởng của yếu tố nồng độ enzymem, nhiệt độ thủy phân, thời gian thủy phân đến khả năng chống oxi hóa của dịch thủy phân. ...................53 Hình 3.10. Đồ thị ảnh hưởng của tương tác giữa hai yếu tố nồng độ enzyme và thời gian thủy phân đến nồng độ DPPH bị khử ......................................................54 Hình 3.11. Đồ thị ảnh hưởng của tương tác giữa hai yếu tố nhiệt độ và thời gian thủy phân đến nồng độ DPPH bị khử của dịch thủy phân ...............................55 Hình 3.16. Đồ thị của hàm lượng protein hòa tan , nồng độ DPPH bị khử và hiệu suất khử protein còn lại .................................................................................62 Hình 3.17. Đồ thị ei vs Run của hàm lượng protein hòa tan, nồng độ DPPH bị khử và hiệu suất khử protein còn lại ......................................................................63 Hình 3.18. Biểu đồ Contour và 3D-surface cho hàm mục tiêu hàm lượng protein hòa tan.......................................................................................................69 Hình 3.19. Biểu đồ Contour cho hàm mục tiêu nồng độ DPPH bị khử ..................69 Hình 3.20. Biểu đồ Contour và 3D-surface cho hàm mục tiêu hiệu suất khử protein còn lại trên bã. ...........................................................................................70 Hình 3.21. Đồ thị biểu diễn thành phần % của các axit amin có trong dịch thủy phân tối ưu. ...........................................................................................................72 viii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT NL : Nguyên liệu XL : Xử lý đv : Đơn vị TLK : Trọng lượng khô DH : Độ thủy phân TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam E : Enzyme S : Cơ chất DPPH : 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl TN : Thí nghiệm RMS : Phương pháp bề mặt đáp ứng BSA : Bovine serum albumin Da : Dalton (Đơn vị khối lượng phân tử peptid) 1 LỜI MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Hiện nay ở nước ta ngành chế biến thủy sản đã trở thành một trong những ngành kinh tế mũi nhọn của đất nước, chiếm một vị trí quan trọng trong nền kinh tế quốc dân. Trong đó, mặt hàng tôm được coi là một trong các mặt hàng xuất khẩu thủy sản chủ lực có mức tăng trưởng khá cao. Với sự phát triển ngày càng cao của khoa học công nghệ, bên cạnh các sản phẩm chính, nguyên liệu còn lại bao gồm đầu và vỏ tôm cũng đã và đang được tận dụng một cách tối đa và hiệu quả như sản xuất bột đạm, thức ăn chăn nuôi, tách chiết astaxanthin, sản xuất chitin-chitosan... Điều này đã góp phần to lớn trong việc xử lý ô nhiễm môi trường, nâng cao giá trị cho ngành thủy sản và tạo thêm nhiều công ăn việc làm, thu nhập cho người dân. Trong phế liệu đầu tôm có chứa tới 50% hàm lượng protein [4] với đủ các thành phần axit amin không thay thế và có giá trị cao về mặt sinh học. Vì thế việc nghiên cứu quá trình thủy phân protein từ đầu tôm này là hết sức cần thiết. Một số nghiên cứu về quá trình thủy phân protein trên đầu tôm đã được quan tâm thực hiện ở nước ta nhưng phương pháp bố trí thí nghiệm được sử dụng chủ yếu là phương pháp cổ điển, vì thế chưa đánh giá được đầy đủ tác động của các yếu tố ảnh hưởng. Nghiên cứu của nhiều tác giả trên thế giới đã chỉ ra rằng quá trình thủy phân protein trên đầu tôm là một quá trình chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố như nồng độ enzyme, nhiệt độ và thời gian thủy phân (Diniz and Martin 1997a; Deng et al. 2002). Vì vậy để có thể hiểu rõ các yếu tố ảnh hưởng và sự tương tác qua lại của chúng cần sử dụng các công cụ toán học hiện đại để hỗ trợ. Box và Wilson đã giới thiệu phương pháp bề mặt đáp ứng (RMS), một công cụ hết sức hiệu quả cho phép nghiên cứu tối ưu các quá trình thủy phân. Trước tình hình đó, dưới sự hướng dẫn của thầy PGS.TS Ngô Đăng Nghĩa và cô Th.S Ngô Thị Hoài Dương, em đã thực hiện đề tài “Ứng dụng phương pháp mặt đáp ứng để tối ưu quá trình thủy phân protein trên đầu tôm thẻ chân trắng bằng enzyme Alcalase”. 2 2. Mục đích của đề tài  Xác lập chế độ thủy phân protein tối ưu trên đầu tôm thẻ chân trắng với Alcalase bằng phương pháp bề mặt đáp ứng để thu hồi đồng thời protein và chitin.  Đặc trưng tính chất của dịch thuỷ phân. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Kết quả của đề tài sẽ là dữ liệu khoa học về sử dụng enzyme trong thu hồi sản phẩm hữu ích từ nguyên liệu còn lại trong quá trình chế biến tôm, đồng thời cho phép tối ưu hoá quá trình sản xuất ở qui mô pilot. 4. Nội dung đề tài  Đánh giá ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt cho nguyên liệu trước khi thuỷ phân và việc bổ sung enzyme Alcalase đến khả năng thủy phân protein trên đầu tôm.  Đánh giá ảnh hưởng của các nhân tố đến quá trình thủy phân protein trên đầu tôm.  Sử dụng phương pháp mặt đáp ứng để tối ưu hóa quá trình thủy phân protein trên đầu tôm thẻ chân trắng bằng enzyme Alcalase.  Đặc trưng hóa tính chất sinh học và dinh dưỡng của dịch thủy phân. 3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Khái quát về phế liệu tôm 1.1.1. Tình hình nuôi trồng, chế biến và xuất khẩu tôm Việt Nam Bờ biển Việt Nam dài 3.444 km với vùng đặc quyền kinh tế 1.000.000 km2 rất thuận lợi để phát triển ngành nuôi trồng và đánh bắt thủy hải sản. Theo số liệu thống kê của Tổng cục Thủy sản, tổng diện tích nuôi tôm cả nước đã tăng từ 327.194 ha năm 2005 đến 381.728 ha năm 2008. Năm 2011, diện tích nuôi tôm cả nước đạt 656.425 ha tôm, sản lượng đạt 495.657 tấn, tăng 2,71% về diện tích và 5,48% về sản lượng so với năm 2010. Trong đó, diện tích n